謝五菊 王成存 吳文漢

(海南西部中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南 儋州 571700)

非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要病理分型，其具有惡性程度高及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，但關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的靶向治療仍為目前臨床治療難點(diǎn)〔1〕。研究表明，非小細(xì)胞肺癌早期檢測(cè)方法的缺乏是導(dǎo)致患者生存率降低的主要原因〔2〕。因此深入研究非小細(xì)胞肺癌發(fā)生及發(fā)展的過程對(duì)早期診斷及治療方案的制定均具有重要意義。研究表明，微小RNA-136(miR-136)在非小細(xì)胞肺癌中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-136可抑制肺癌細(xì)胞增殖及遷移〔3，4〕。相關(guān)研究報(bào)道指出，miR-136可通過靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因(aEg)1和Bcl-2進(jìn)而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡〔5〕。但miR-136對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及凋亡的研究未見報(bào)道。通過生物學(xué)信息手段檢測(cè)miR-136的靶基因發(fā)現(xiàn)FZD4可能是miR-136的靶基因，研究表明FZD4在非小細(xì)胞肺癌組織中上調(diào)表達(dá)，并可通過Wnt/β-連環(huán)蛋白(catenin)信號(hào)通路調(diào)控肺癌細(xì)胞遷移和侵襲及EMT的發(fā)生〔6，7〕。然而，有關(guān)miR-136與FZD4在非小細(xì)胞肺癌中的研究相對(duì)較少，本研究旨在探討miR-136在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及凋亡過程中的作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B與人肺癌細(xì)胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；miR-136 mimic、miR-con均購自美國Ambion公司；胎牛血清與RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技公司；FDZ4抗體與β-actin抗體均購自美國Epigentek公司；Trizol試劑購自美國Ambion公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自美國Kapa公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國GeneCopoeia公司；熒光素酶報(bào)告載體與熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒均購自美國Promega公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)購自美國Amresco公司；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4抗體購自美國CST公司；細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-9、Bax、Bcl-2抗體均購自美國Epitomics公司；兔抗糖原合成酶激酶(GSK)-3β、β-catenin、c-Myc抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；核蛋白提取試劑盒購自美國ThermoFisher公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 人正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B與人肺癌細(xì)胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446放入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到70%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SPC-A-1細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)細(xì)胞/ml，以每孔2 ml體積的細(xì)胞接種于6孔板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)50%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)分別將miR-136 mimic、miR-con、anti-miR-NC、anti-miR-136轉(zhuǎn)染于SPC-A-1細(xì)胞中，為明確miR-136與FDZ4的調(diào)控作用及其對(duì)SPC-A-1細(xì)胞增殖及凋亡的影響，將miR-136 mimic分別與pcDNA-FDZ4、pcDNA共轉(zhuǎn)染于SPC-A-1細(xì)胞，分別為miR-136+pcDNA-FDZ4組、miR-136+pcDNA組。轉(zhuǎn)染步驟：①根據(jù)Lipofectamine2000試劑盒說明書配置Lipofectamine2000與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的復(fù)合體混合液；②不含血清培養(yǎng)液洗滌待轉(zhuǎn)染細(xì)胞并加入1 ml不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基；③復(fù)合體混合液加入6孔板；④轉(zhuǎn)染6 h后更換含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞。

1.3qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-136、FDZ4 mRNA表達(dá)水平 分別收集BEAS-2B、H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446與轉(zhuǎn)染后各組SPC-A-1細(xì)胞，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)：配置反應(yīng)體系與實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)。反應(yīng)體系為20 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.6 μl，滅菌ddH2O 6.8 μl。PCR儀擴(kuò)增程序：95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40次循環(huán)。miR-136以U6為內(nèi)參，F(xiàn)DZ4 以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算不同細(xì)胞中檢測(cè)miR-136、FDZ4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4Western印跡檢測(cè)FDZ4、CDK4、CyclinD1、Caspase-9、Bax、Bcl-2及WNT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 分別收集各組細(xì)胞分別加入蛋白裂解液( 1 ml RIPA、1% PMSF、0.1% 抑肽酶)提取細(xì)胞總蛋白，另收集miR-136+pcDNA組、miR-136+pcDNA-FDZ4組SPC-A-1細(xì)胞加入核蛋白提取試劑提取細(xì)胞核總蛋白以檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)，其余蛋白表達(dá)檢測(cè)均選用細(xì)胞總蛋白。分別檢測(cè)蛋白濃度后取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)反應(yīng)分離蛋白，將蛋白凝膠移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入一抗，4℃孵育24 h，TBST洗滌3次×10 min，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次×10 min，滴加ECL發(fā)光劑，凝膠成像分析儀檢測(cè)各蛋白條帶并用Image圖像分析軟件分析條帶灰度值。

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 分別收集各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞后以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種至96孔板，每個(gè)樣本均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)在每孔加入20 μl MTT試劑，培養(yǎng)4 h后每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min后選擇波長(zhǎng)為490 nm在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔光密度(OD)值。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組SPC-A-1細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，取1×106個(gè)細(xì)胞加入結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞(100 μl)，依次加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，混勻后避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組SPC-A-1細(xì)胞凋亡率。

1.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 用生物學(xué)信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-136的潛在靶標(biāo)，F(xiàn)DZ4 3′UTR與miR-136存在結(jié)合位點(diǎn)，將含有FDZ4 3′UTR野生序列片段(WT-FDZ4)與FDZ4 3′UTR突變序列(MUT-FDZ4)分別插入熒光素酶報(bào)告基因載體，轉(zhuǎn)染前1 d收集SPC-A-1細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種至24孔板，將WT-FDZ4、MUT-FDZ4分別與miR-136 mimic或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至SPC-A-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后根據(jù)雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-136和FDZ4在人肺癌細(xì)胞和人正常肺上皮細(xì)胞中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，與BEAS-2B細(xì)胞比較，miR-136在H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446細(xì)胞中的表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)，其中以SPC-A-1細(xì)胞下調(diào)最為明顯，而FDZ4 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，其中以SPC-A-1細(xì)胞上調(diào)最為明顯，見圖1、表1。本研究選取SPC-A-1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 miR-136和FDZ4在人正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B和人肺癌細(xì)胞株H1299、A549、SPC-A-1、NC-H446中的表達(dá)

圖1 檢測(cè)FDZ4蛋白表達(dá)

2.2上調(diào) miR-136表達(dá)對(duì)人肺癌細(xì)胞株SPC-A-1增殖的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，與miR-con組比較，miR-136組SPC-A-1細(xì)胞中miR-136表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)，而NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MTT結(jié)果顯示，miR-136組SPC-A-1細(xì)胞增殖能力在48、72、96 h后明顯受到抑制，與miR-con組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。Western印跡結(jié)果顯示，miR-136組CDK4、CyclinD1蛋白表達(dá)水平較miR-con組明顯降低(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 檢測(cè)人肺癌細(xì)胞株SPC-A-1增殖相關(guān)蛋白CDK4和Cyclin D1表達(dá)

表2 上調(diào)miR-136表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

2.3上調(diào)miR-136表達(dá)對(duì)人肺癌細(xì)胞株SPC-A-1凋亡的影響 miR-136組SPC-A-1細(xì)胞凋亡率顯著高于miR-con組、NC組(P<0.05)。Western印跡結(jié)果顯示，相較于miR-con組，miR-136組SPC-A-1細(xì)胞中Caspase-9、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖3，圖4，表3。

圖3 人肺癌細(xì)胞株SPC-A-1凋亡率

圖4 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)

表3 上調(diào)miR-136表達(dá)對(duì)人肺癌細(xì)胞株SPC-A-1凋亡的影響

2.4miR-136靶向調(diào)控FDZ4蛋白表達(dá) FDZ4與miR-136存在結(jié)合靶點(diǎn)，見圖5。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-136 mimic可顯著降低WT-FDZ4的熒光素酶活性(P<0.05)，而不能抑制MUT-FDZ4的熒光素酶活性(P>0.05)，見表4。Western印跡結(jié)果顯示，miR-136組FDZ4蛋白表達(dá)(0.28±0.04)顯著低于miR-con組(0.67±0.06，P<0.05)，anti-miR-136組(0.88±0.09)顯著高于anti-miR-con組(0.62±0.07，P<0.05)，見圖6。

圖5 FDZ4的3′UTR中含有與miR-136互補(bǔ)的核苷酸序列

圖6 Western印跡檢測(cè)miR-136對(duì)FDZ4蛋白表達(dá)的影響

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5FDZ4過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-136抑制人肺癌細(xì)胞株SPC-A-1增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用 MTT結(jié)果顯示，與miR-136+pcDNA組比較，miR-136+pcDNA-FDZ4組SPC-A-1細(xì)胞增殖活性在48、72、96 h明顯增強(qiáng)(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-136+pcDNA-FDZ4組SPC-A-1細(xì)胞凋亡率明顯低于miR-136+pcDNA組(P<0.05)，Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-136 mimic與pcDNA-FDZ4后SPC-A-1細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，而Caspase-9蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，見表5、圖7。

表5 FDZ4過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-136抑制人肺癌細(xì)胞株SPC-A-1增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用

圖7 人肺癌細(xì)胞株SPC-A-1中FDZ4、CyclinD1和Caspase-9蛋白表達(dá)

2.6miR-136和FDZ4的表達(dá)對(duì)人肺癌細(xì)胞株SPC-A-1中WNT信號(hào)通路的影響 Western印跡結(jié)果顯示，SPC-A-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-136 mimic后GSK-3β蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，而β-catenin、c-Myc蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，共轉(zhuǎn)染miR-136 mimic與pcDNA-FDZ4后SPC-A-1細(xì)胞中GSK-3β蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而β-catenin、c-Myc蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，見表6、圖8。

圖8 檢測(cè)人肺癌細(xì)胞株SPC-A-1中β-catenin、GSK-3β和c-Myc蛋白表達(dá)

表6 FDZ4過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-136對(duì)人肺癌細(xì)胞株SPC-A-1WNT信號(hào)通路的作用

3 討 論

非小細(xì)胞肺癌是常見的惡性腫瘤之一，由于早期患者臨床癥狀隱匿導(dǎo)致確診時(shí)已處于中晚期，目前采用手術(shù)治療晚期患者，但治療效果不佳且患者預(yù)后較差〔8〕。因而關(guān)于非小細(xì)胞肺癌新型生物標(biāo)志物機(jī)制新型治療靶點(diǎn)的探究成為熱點(diǎn)。研究表明miRNA可調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及增殖、遷移等生物學(xué)過程〔9〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-106可通過調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)進(jìn)而影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及凋亡過程〔10〕。但關(guān)于miRNA與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生及發(fā)展的研究仍相對(duì)較少，因此積極尋找新型miRNA有助于臨床早期診斷及治療。

miR-136在乳腺癌、肺鱗癌等多種惡性腫瘤中均呈低表達(dá)，并可通過調(diào)控下游靶基因表達(dá)進(jìn)而參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔11,12〕。Guo等〔13〕研究表明，miR-136可通過調(diào)節(jié)metadherin表達(dá)進(jìn)而抑制骨肉瘤發(fā)生及發(fā)展。miR-136還可通過靶向環(huán)氧合酶2進(jìn)而抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展〔14〕。研究表明抗癌藥物的研究多以調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)因子為治療靶點(diǎn)，Cyclin D1作為細(xì)胞周期的啟動(dòng)因子可與CDK4結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期轉(zhuǎn)化為S期從而促進(jìn)細(xì)胞增殖〔15，16〕。提示miR-136過表達(dá)后主要通過下調(diào)CDK4、Cyclin D1水平影響細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變?yōu)镾期而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯于G1期進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果表明SPC-A-1細(xì)胞中上調(diào)miR-136表達(dá)可增加細(xì)胞凋亡率。研究表明，通過抑制Caspase-9、Bax表達(dá)及促進(jìn)Bcl-2表達(dá)可有效促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔17〕。提示miR-136可通過影響細(xì)胞增殖及凋亡蛋白表達(dá)進(jìn)而參與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生及發(fā)展過程。

FDZ4在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)并可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲〔18〕。研究報(bào)道，F(xiàn)DZ4可作為癌基因并通過調(diào)控WNT信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化〔19〕。本研究結(jié)果顯示不同非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中FDZ4表達(dá)水平均顯著升高，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)FDZ4是miR-136的靶基因，本研究結(jié)果提示miR-136可靶向抑制FDZ4表達(dá)并通過影響細(xì)胞增殖及凋亡蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌凋亡并減弱細(xì)胞增殖能力。WNT信號(hào)通路異常激活可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，如何抑制WNT信號(hào)通路激活進(jìn)程成為非小細(xì)胞肺癌治療的重要輔助治療手段〔20，21〕。GSK-3β是WNT信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控因子，而β-catenin是WNT信號(hào)通路的正性調(diào)控因子，研究表明GSK-3β可通過與β-catenin結(jié)合進(jìn)而促使其降解導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)β-catenin水平降低，若WNT信號(hào)通路異常激活導(dǎo)致GSK-3β水平降低，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin未被及時(shí)降解導(dǎo)致其進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)下游c-Myc等靶基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生及發(fā)展〔22，23〕。本研究結(jié)果表明上調(diào)miR-136可抑制WNT信號(hào)通路活化，但上調(diào)FDZ4表達(dá)可激活WNT信號(hào)通路。提示miR-136可靶向調(diào)節(jié)FDZ4表達(dá)并通過抑制WNT信號(hào)通路而影響細(xì)胞增殖相關(guān)因子表達(dá)進(jìn)而參與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生及發(fā)展過程。

綜上，miR-136在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而FDZ4表達(dá)上調(diào)，miR-136可通過下調(diào)FDZ4抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其可能通過抑制WNT信號(hào)通路而發(fā)揮作用，可為非小細(xì)胞肺癌靶向治療提供理論依據(jù)。