張朋朋 陳勇 郭江福 韓全勝 羅銳

(貴州省人民醫(yī)院急診外科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

目前老年骨質(zhì)疏松尚無(wú)理想的根治方法，疾病治療的主要目標(biāo)是延緩骨質(zhì)疏松的發(fā)展速度。研究證實(shí)，氧化應(yīng)激生成的活性氧會(huì)影響成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞，將破壞成骨與破骨細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)平衡，增加骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)〔1〕。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松患者機(jī)體抗氧化劑、氧化劑之間存在水平表達(dá)不平衡的情況，氧化劑水平明顯高于抗氧化劑水平〔2〕。激素替代療法是目前骨質(zhì)疏松防治主要手段，但隨著激素替代療法的廣泛應(yīng)用，其帶來(lái)的危害逐漸顯現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)，英國(guó)在1993～2003年期間，>50歲女性經(jīng)激素替代療法防治骨質(zhì)疏松導(dǎo)致了至少2萬(wàn)例乳腺癌的發(fā)生〔3〕，且該治療帶來(lái)的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)在國(guó)內(nèi)也有相關(guān)概述〔4〕?？梢娂に靥娲鷳?yīng)用的安全性有待商榷，還應(yīng)繼續(xù)探討更為安全性的新治療方法。魚腥草素主要活性成分魚腥草素鈉化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以抑制炎癥發(fā)生，還具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化血管中膜增厚等作用〔5〕。本研究探討魚腥草素對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響，旨在為骨質(zhì)疏松的防治提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的雄性SD大鼠，體重200 g，日齡均≤3 d。

1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑 魚腥草素、Ⅱ型膠原酶、胰酶等均購(gòu)自北京索萊寶科技；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自四季青生物工程；購(gòu)自賽業(yè)生物科技的成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒，購(gòu)自同仁化學(xué)研究所的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8；購(gòu)自南京建成生物的堿性磷酸酶試劑盒。

1.3主要儀器 上海點(diǎn)科學(xué)儀器提供pH測(cè)定儀(PHS-3C型)，OLYMPUS公司提供生物顯微鏡(BX51型)、倒置顯微鏡(IX71型)；北京白洋醫(yī)療器械提供醫(yī)用離心機(jī)(BY-320A型)；上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械提供恒溫水溫箱(HH-W21-600BS型)，美國(guó)熱電公司提供全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan Asccen型)；英國(guó)埃爾格公司提供超純水機(jī)(PURLABULTRA型)；美國(guó)Thermo公司提供二氧化碳培養(yǎng)箱(371型)，日本Sanyo提供超低溫冰箱，梅特勒托利多集團(tuán)提供酸度計(jì)(PHSJ-3F型)、電子天平(AE240型)，Scotsman集團(tuán)提供制冰機(jī)(AF100型)，美國(guó)Thwemolyne公司提供旋渦混合器。

1.4獲取并培養(yǎng)成骨細(xì)胞 麻醉后處死大鼠，無(wú)菌取顱骨，徹底剝除骨膜等主要軟組織，充分剪碎顱骨，緩沖液沖洗并加入適量的胰蛋白酶，消化后加入培養(yǎng)基(含胎牛血清)消化終止，去除消化液，向內(nèi)加入膠原酶Ⅱ消化，時(shí)間為30 min，將消化液去除；向內(nèi)再次加入膠原酶Ⅱ消化，時(shí)間為60 min，使用15 ml離心管，將消化液移至離心管內(nèi)，離心處理后丟棄上清液，并向內(nèi)加入適量胎牛血清，制作細(xì)胞懸液，移液器移入細(xì)胞懸液至培養(yǎng)瓶，在5%二氧化碳分壓、37℃、合理胞核濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)期間換液，使用倒置顯微鏡對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況仔細(xì)觀察。等到整個(gè)瓶底鋪滿細(xì)胞后吸出培養(yǎng)液，使用胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。使用第三代細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。使用成骨誘導(dǎo)液將魚腥草素配置為0、1、10、20、30、40 μmol/L 6種濃度培養(yǎng)液。

1.5CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖 使用胰蛋白酶消化后第三代細(xì)胞，接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，100 μl/孔，分別向孔內(nèi)加入濃度為0、1、10、20、30、40 μmol/L的魚腥草素+成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液，在5%二氧化碳體積分?jǐn)?shù)、37℃的條件下培養(yǎng)，并將未加入魚腥草素的第三代細(xì)胞作為空白對(duì)照，分別在第1、4、7、10天向每孔內(nèi)加入10 μl CCK-8溶液，細(xì)胞培養(yǎng)板孵育，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

1.6采用茜素紅染色法評(píng)價(jià)礦化結(jié)節(jié)情況 細(xì)胞接種方法不變，培養(yǎng)時(shí)間為15 d，參照文獻(xiàn)〔6〕中相關(guān)方法，使用茜素紅染色法評(píng)價(jià)不同魚腥草素濃度的礦化能力。2次去培養(yǎng)基磷酸鹽緩沖液沖洗，乙醇固定1 h后加入茜素紅S 40 mmol/L作用10 min，緩沖液洗滌3次，使用倒置顯微鏡觀察。后向內(nèi)加入氧化十六烷基吡啶(CPC)孵育，時(shí)間為15 min，細(xì)胞基質(zhì)釋放染料在562 nm波長(zhǎng)下觀測(cè)吸光度定量。

1.7采用Western印跡法測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)蛋白水平 以4×104/皿的密度將細(xì)胞接種在10 cm培養(yǎng)皿上，第10天時(shí)參照文獻(xiàn)〔7〕中體積方法提取蛋白。放射免疫沉淀(RIPA)裂解液裂解離心細(xì)胞后取上清液得到總蛋白，蛋白濃度試劑盒檢測(cè)后分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。封閉加入稀一抗-抗大鼠ALP抗體過(guò)夜。洗滌與稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗孵育60 min。再次洗滌，使用化學(xué)發(fā)光液與伯樂(lè)分子影響系統(tǒng)收集圖像并仔細(xì)分析。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶作為蛋白表達(dá)量?jī)?nèi)參。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)520 nm處吸光度，記錄數(shù)據(jù)后根據(jù)公式計(jì)算ALP蛋白活性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)觀察 接種培養(yǎng)細(xì)胞4 h后貼壁，形態(tài)多為多角形、三角形或紡錘形，經(jīng)24 h培養(yǎng)后可見細(xì)胞數(shù)量上升、體積增加、有交聯(lián)融合發(fā)生，如圖1；經(jīng)7 d成骨誘導(dǎo)后，采用茜素紅染色發(fā)現(xiàn)小鈣化結(jié)節(jié)，如圖2。

圖1 大鼠干細(xì)胞接種培養(yǎng)24 h(×4)

圖2 大鼠干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天(茜素紅染色，×100)

2.2成骨細(xì)胞增殖抑制情況 魚腥草素作用2、7 d后，空白對(duì)照組、1、10、20、30、40 μmol/L組吸光度值隨著濃度增加均呈下降趨勢(shì)，各時(shí)點(diǎn)各組吸光度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。即隨著魚腥草素濃度升高，成骨細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng)，直至40 μmol/L濃度時(shí)成骨細(xì)胞增殖抑制作用有所緩解。見表1。

表1 各組體外培養(yǎng)不同時(shí)間大鼠成骨細(xì)胞增殖抑制作用吸光度值比較

與0 μmol/L比較：1)P<0.05；與1 μmol/L比較:2)P<0.05；與10 μmol/L比較:3)P<0.05；與20 μmol/L比較:4)P<0.05；與30 μmol/L比較:5)P<0.05；表2、3同

2.3礦化結(jié)節(jié)染色結(jié)果 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14 d后，采用茜素紅染色結(jié)果顯示，10、20 μmol/L組礦化結(jié)節(jié)數(shù)多于其他各組，其他各組中40 μmol/L組培養(yǎng)各時(shí)點(diǎn)礦化結(jié)節(jié)數(shù)最少，其他濃度組培養(yǎng)7 d時(shí)，礦化結(jié)節(jié)數(shù)由少至多依次為空白對(duì)照組、1 μmol/L組、30 μmol/L組；培養(yǎng)14 d時(shí)依次為空白對(duì)照組、30 μmol/L組、1 μmol/L組，各組間礦化結(jié)節(jié)數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組培養(yǎng)不同時(shí)間礦化結(jié)節(jié)數(shù)比較個(gè)/孔，n=16)

2.4ALP活性測(cè)定結(jié)果 在同一時(shí)間點(diǎn)，魚腥草素濃度為10～20 μmol/L時(shí)ALP活性最高，當(dāng)濃度升高至30～40 μmol/L時(shí)有ALP活性抑制出現(xiàn)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)ALP活性促進(jìn)或抑制情況繼續(xù)增強(qiáng)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組培養(yǎng)不同時(shí)間ALP活性測(cè)定結(jié)果比較吸光度/μg)

3 討 論

體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞是研究成骨細(xì)胞功能與特性的重要工具，但因成骨細(xì)胞在礦化后有硬組織包裹，故取材相對(duì)困難〔8〕。目前，體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的各類技術(shù)已經(jīng)逐漸成熟，包括原代細(xì)胞培養(yǎng)、骨組織培養(yǎng)等，其他間質(zhì)干細(xì)胞分離提取誘導(dǎo)的方法也有使用，但這些體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的方法均有局限性，如骨細(xì)胞數(shù)量不夠、骨細(xì)胞純度低下、骨細(xì)胞活性低下等〔9，10〕。本研究中將大鼠顱骨粉碎并經(jīng)酶消化，將消化液與未完全消化骨片共同培養(yǎng)，分離提取原代成骨細(xì)胞，該體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞的方法，較其他成骨細(xì)胞提取技術(shù)更具優(yōu)勢(shì)，其步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，培養(yǎng)細(xì)胞的活性更強(qiáng)，純度也更高，用于臨床實(shí)驗(yàn)研究更具價(jià)值〔11〕。

成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞二者在功能方面存在動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，二者之間平衡關(guān)系是保證并維持骨組織正常的基礎(chǔ)，一旦二者之間的平衡關(guān)系被破壞，成骨細(xì)胞凋亡速度將明顯加快，短時(shí)間內(nèi)成骨細(xì)胞數(shù)量將大大減少，此時(shí)破骨細(xì)胞凋亡受抑制，增加骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)〔12～14〕。此外，骨質(zhì)疏松的發(fā)展還與機(jī)體免疫系統(tǒng)緊密相關(guān)，免疫系統(tǒng)受到外界不良刺激后異常激活，免疫系統(tǒng)的異常激活會(huì)對(duì)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞產(chǎn)生影響，使得二者動(dòng)態(tài)平衡打破；此外，免疫系統(tǒng)在發(fā)生異常后，還會(huì)產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子將通過(guò)各自對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路與對(duì)應(yīng)受體相結(jié)合，對(duì)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的平衡產(chǎn)生影響，最終誘發(fā)骨質(zhì)疏松〔15，16〕。目前，可以用于骨質(zhì)疏松治療且很好改善患者成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞平衡的藥物并不多見，多數(shù)藥物的使用僅僅只能延緩患者疾病進(jìn)程，在治療上均無(wú)法達(dá)到預(yù)期。故為骨質(zhì)疏松患者成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間功能不平衡狀態(tài)找到一個(gè)新的治療靶點(diǎn)與方向一直是臨床研究的難點(diǎn)。魚腥草素又名癸酰乙醛，是三百草科植物蕺菜揮發(fā)油主要抗菌成分，是一種具有揮發(fā)性氣味的芳香油，在臨床上多用于免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的治療，對(duì)諸多菌種有著理想的抑制作用，可增強(qiáng)機(jī)體白細(xì)胞吞噬能力，調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫力〔17〕。朱善元等〔18〕在研究中發(fā)現(xiàn)，魚腥草素的使用能夠刺激淋巴細(xì)胞增殖能力，對(duì)動(dòng)物免疫功能的影響好。

考慮成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞間功能不平衡可能與機(jī)體免疫系統(tǒng)有關(guān)，本研究將不同濃度的魚腥草素用于體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)，結(jié)果顯示，魚腥草素可能具有抑制骨吸收、抑制破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)、抑制成骨細(xì)胞凋亡等功效，可以考慮將其作為未來(lái)骨質(zhì)疏松治療藥物研究的新靶點(diǎn)。因本研究只是研究魚腥草素對(duì)成骨細(xì)胞功能影響及受體表達(dá)具體情況，加之無(wú)循證學(xué)依據(jù)作為理論支持，故還需要繼續(xù)研究魚腥草素具體的作用機(jī)制及信號(hào)通路，其是否對(duì)機(jī)體骨骼系統(tǒng)有影響還需要進(jìn)一步行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。