肖韓艷 陳光 韓民 王冬梅 徐甜穎 周淑芬

(牡丹江醫(yī)學(xué)院 1附屬第二醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157000；2附屬紅旗醫(yī)院；3牡丹江市第二人民醫(yī)院)

隨著中國(guó)人口老齡化社會(huì)的到來(lái)，缺血性腦血管病發(fā)病率逐年升高，該病死亡率高、致殘率高及復(fù)發(fā)率高，是目前臨床工作的重點(diǎn)難點(diǎn)〔1〕。為了改善預(yù)后，現(xiàn)在大多數(shù)研究集中在缺血/再灌注(I/R)損傷和缺血半暗帶與其之間的聯(lián)系〔2〕。人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)是腦部微血管的組成單位，在一定程度上直接決定了缺血區(qū)血管新生，進(jìn)而影響腦組織能否恢復(fù)和臨床預(yù)后〔3〕。本實(shí)驗(yàn)觀察促紅細(xì)胞生成素(EPO)衍生肽(HBSP)對(duì)I/R的BMECs的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠2只，體重80～100 g，2周齡，購(gòu)自牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。CO2恒溫孵箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Biofuge公司，AE-100電子分析天平購(gòu)自瑞士Mettler公司，化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Western印跡系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)UVP公司。DMEM培養(yǎng)基(低糖)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，Ⅱ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，HBSP購(gòu)自上海科膚生物科技有限公司，噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，電化學(xué)發(fā)光加強(qiáng)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2大鼠BMECs制備 采集2周齡SD大鼠大腦皮質(zhì)，應(yīng)用Ⅱ型膠原酶和分散酶+膠原酶連續(xù)消化法，篩網(wǎng)過濾法及兩次梯度離心法獲得腦微血管段后，接種于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代培養(yǎng)，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，以Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫染色法進(jìn)行鑒定。

1.3構(gòu)建模擬I/R模型 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMECs，沖洗后，更換為缺血液；置于 CO25%、O21%、N294%的缺氧孵箱中模擬缺血。2 h后將培養(yǎng)液更換為正常培養(yǎng)液，置于恒溫 37℃、含5% CO2的正常孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

1.4分組 隨機(jī)分為對(duì)照組(不加任何干預(yù))；I/R組、I/R+HBSP組(以1.2中方法缺血培養(yǎng)后，再灌注時(shí)分別加入2.5、25.0、50.0、100.0 ng/ml的HBSP)。

1.5采用MTT法檢測(cè)BMECs增殖數(shù)目 BMECs接種于96孔板，分組建立模型。每孔加入MTT溶液，每孔加入DMSO室溫下?lián)u床低速震蕩10～15 min。于波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值(A值)。

1.6TUNEL法檢測(cè)BMECs的凋亡 細(xì)胞爬片的制備，固定，破膜，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組，滴加TUNEL反應(yīng)液，陰性對(duì)照組只加酶濃縮液(viall液)。磷酸鹽緩沖液(PBS)液浸洗3次，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)反應(yīng)液，于倒置熒光顯微鏡下，拍照后統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，每張爬片隨機(jī)取5個(gè)視野，取平均值。計(jì)算凋亡率(AI)及凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.7Western印跡法檢測(cè)蛋白激酶B(Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖體40 S小亞基S6蛋白激酶(p70S6K)的表達(dá)及磷酸化(p)水平 BMECs蛋白樣品的制備及定量后，選取了濃度為8%和10%的分離膠，將制備好的蛋白樣品取出，3 000 r/min離心5 min，上樣孔內(nèi)加入蛋白樣品及蛋白Marker。電泳、轉(zhuǎn)膜后抗體雜交后發(fā)光檢測(cè)，放入凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，用軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1BMECs增殖能力 與對(duì)照組相比，I/R組吸光度值明顯下降(P<0.05)。不同濃度HBSP組吸光度顯著高于I/R組(P<0.05)，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中I/R+25 ng/ml HBSP組增殖能力最強(qiáng)，見表1。

2.2HBSP對(duì)I/R誘導(dǎo)的BMECs凋亡的影響 與對(duì)照組相比，I/R組BMECs的凋亡率顯著增加(P<0.05)。與I/R組相比，不同濃度的HBSP組凋亡率均明顯下降(P<0.05)，下降最明顯的為I/R+25.0 ng/ml HBSP組。見表1。

表1 各組BMBCs增殖能力和凋亡率的比較

2.3pAkt、pmTOR、pp70S6K蛋白水平 與I/R組相比，I/R+25.0 ng/ml HBSP組pAkt、pmTOR、pp70S6K水平均顯著性增高(P<0.05)，見表2，圖1。

表2 各組pAkt，pmTOR,pp70S6K蛋白水平比較

1～3：對(duì)照組、I/R組、I/R+25.0 ng/ml HBSP組圖1 Western印跡法檢測(cè)Akt、mTOR、p70S6K蛋白及其磷酸化水平

3 討 論

血管新生是近年來(lái)缺血性腦血管病的研究熱點(diǎn)及可能的治療作用點(diǎn)〔4,5〕，血管新生主要是BMECs的形態(tài)改變和數(shù)量增多，從而促進(jìn)新生血管增加，使缺血區(qū)腦組織再灌注，改善臨床癥狀〔6〕。

血管新生是一個(gè)復(fù)雜過程，多個(gè)細(xì)胞及細(xì)胞因子通過多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參其中，具體新生過程不完全明確，但這卻是一個(gè)潛在的治療方向，是目前的研究熱點(diǎn)。其中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt/mTOR信號(hào)通路參與調(diào)控了細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡、血管的生成等。以往研究證實(shí)PI3K/Akt通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK/ERK)通路在EPO保護(hù)腸上皮時(shí)起作用〔7〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HBSP可通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路起到保護(hù)SI/R損傷后BMECs的作用，使其活性增強(qiáng)，抑制其凋亡。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，EPO在人類海馬、皮層神經(jīng)元、杏仁核、丘腦等腦組織廣泛分布，可能是神經(jīng)系統(tǒng)中的一個(gè)新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子〔8〕，EPO有促紅細(xì)胞生成、促血栓形成作用，這是目前臨床主要應(yīng)用方向，但在促進(jìn)血管新生時(shí)這些副作用限制了其臨床應(yīng)用。HBSP是一種可以和 EPO 組織受體(EPOR-βcR)特異性結(jié)合的線性多肽鏈，在糖尿病大鼠模型、鼠腦卒中模型、坐骨神經(jīng)擠壓傷動(dòng)物模型等實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)其具有刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)膠表面遷移、形成管樣分支和吻合的作用〔9〕，還有抑制顱內(nèi)炎癥反應(yīng)、保護(hù)神經(jīng)元作用，這些作用與EPO相似，且無(wú)不良反應(yīng)的發(fā)生〔10〕。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HBSP對(duì)I/R的BMECs 有保護(hù)作用，為急性缺血性腦卒中患者的治療提供了新的方向。