孫紅爽 乜春城 李鵬霖 劉永雙 高玲娜

(衡水市人民醫(yī)院，河北 衡水 053000)

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一種與胰島素抵抗、糖尿病、肥胖等代謝高危因素密切相關(guān)的應(yīng)激性肝損傷，以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征，按照其病程的進(jìn)展程度依次分為單純性脂肪肝變性、脂肪性肝炎、肝臟纖維化、肝硬化及肝癌〔1，2〕。目前關(guān)于NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但氧化應(yīng)激在NAFLD進(jìn)展中的重要作用已被普遍認(rèn)同，本研究選用“萬能抗氧化劑”α-硫辛酸(LA)，觀察其對(duì)高熱量飼料引起大鼠NAFLD及氧化應(yīng)激的治療作用，為NAFLD的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 LA(鄭州荔諾生物科技有限公司，ALXS160216-2)；游離脂肪酸測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒(南京建成生物工程研究所，20161216)；三酰甘油測定試劑盒、總膽固醇(TC)測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒(長春匯力生物技術(shù)有限公司，20161220)；腫瘤壞死因子(TNF)放射免疫分析藥盒(北京北方生物技術(shù)研究所，20161220)；紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司：T6系列)；γ放射免疫計(jì)數(shù)器(合肥眾成生物工程設(shè)備有限公司：M-96型)；PCR儀(美國Applied Biosystems公司：GeneAmp PCR System 9600)。

1.2動(dòng)物與分組 32只清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，購自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重150～200 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK滬2002-0002。動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，恒溫、恒濕，明暗周期12 h，自由飲食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，將大鼠按體重隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、LA低劑量(LA-1)組和LA高劑量(LA-2)組，每組8只。對(duì)照組喂食普通飼料，其余3組喂食高熱量飼料，高熱量飼料配方：20%豬油+8%糖+3%膽固醇+3%食鹽+66%基礎(chǔ)飼料。8 w后開始給藥，LA-1組給予α-LA 50 mg/(kg·d)灌胃，LA-2組給α-LA 100 mg/(kg·d)灌胃。α-LA預(yù)先用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成混懸液，對(duì)照組及模型組給予相同體積的0.5% 羧甲基纖維素鈉溶液。給藥4 w后檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1肝指數(shù)(HI) 給藥4 w后，大鼠禁食12 h，稱體重，20%烏拉坦注射液腹腔注射麻醉(0.5 ml/100 g)。頸動(dòng)脈插管取血，血樣3 500 r/min離心10 min獲取上層血清，于-20℃冰箱保存。取全部肝臟，在4℃生理鹽水中沖洗，濾紙吸干表面水分，稱重。HI(mg/g)=肝臟重量(g)/體重(g)×100%。

1.3.2血液學(xué)指標(biāo) 血清游離脂肪酸(FFA)、TC、三酰甘油(TG)、HDL-C用比色法檢測；血清TNF-α用DFM-96型16管放射γ免疫計(jì)數(shù)器檢測；SOD用羥胺法檢測，MDA用TBA法檢測，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3.3肝臟生化指標(biāo) 將新鮮肝組織0.2 g加入2 ml生理鹽水中，4℃下勻漿，制成10%肝組織勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液置于-20℃冰箱中，用于生化指標(biāo)測定。

1.3.4肝臟TNF-α mRNA表達(dá)量 取新鮮肝組織100 mg，用磷酸鹽緩沖液反復(fù)漂洗，洗凈淤血，置于-80℃冰箱凍存，測定TNF-α mRNA表達(dá)量。TNF-α上游引物5′-CAGACCCTCACACTCAGATCA-3′，下游引物5′-TCTCCTGGTATGAAATGGCA-3′，引物長度270 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃，30 min預(yù)變性，然后94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s運(yùn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，采用全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，并計(jì)算相對(duì)灰度，相對(duì)灰度=各組泳道灰度/對(duì)應(yīng)泳道內(nèi)參灰度。

1.3.5肝組織形態(tài)學(xué)觀察 將大鼠新鮮肝組織在4℃磷酸鹽緩沖液中反復(fù)洗滌，用10%中性甲醛固定，酒精梯度脫水，切片，用蘇木精-伊紅染色法染色。參照非酒精性脂肪性肝炎(NASH)臨床研究評(píng)分系統(tǒng)〔3〕，從5個(gè)方面評(píng)價(jià)肝組織病變程度：脂變(0～3分)、小葉炎癥(0～3分)、匯管區(qū)炎癥(0～1分)、肝細(xì)胞氣球樣變(0～2分)和肝組織纖維化(0～4分)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：脂肪變性：肝細(xì)胞脂肪變性百分比<5% 0分，5%～33% 1分，34%～66% 2分，>66% 3分；纖維化：無0分，竇周狀或門靜脈周圍1分，弱的、3區(qū)、竇周狀的1A分，中等的、3區(qū)、竇周狀的1B分，門靜脈或門靜脈周圍的1C分，竇周狀的和門靜脈/門靜脈周圍的2分，橋連的纖維化3分，硬化4分；肝小葉炎癥：所有的炎癥病灶無0分，<2個(gè)200倍視野1分，2～4個(gè)200倍視野2分，>4個(gè)200倍視野3分；匯管區(qū)炎癥：在低放大倍數(shù)下無到極輕的0分，大于極輕的1分；氣球樣變：無0分，少數(shù)細(xì)胞氣球樣變1分，多數(shù)細(xì)胞氣球樣變或顯著的氣球樣變2分。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HI 給藥4 w后，與對(duì)照組〔(23.12±1.13)mg/g〕比較，模型組HI〔(25.71±1.09)mg/g〕顯著增大(P<0.01)；與模型組比較，LA-1組及LA-2組HI〔(25.04±0.76)、(24.57±1.53)mg/g〕均有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組血清SOD活力及MDA濃度比較 與對(duì)照組比較，模型組SOD活力顯著下降，MDA濃度顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，LA-1組及LA-2組SOD活力顯著升高，MDA濃度顯著降低，且LA-2組變化更明顯(P<0.05,P<0.01)，見表1。

2.3各組血脂結(jié)果比較 與對(duì)照組比較，模型組TC、TG、FFA、TNF-α濃度均顯著升高，HDL濃度顯著下降(均P<0.01)；與模型組比較，LA-1組及LA-2組TC、FFA、TNF-α濃度均顯著下降 (P<0.01)，TG、HDL有變化趨勢，但無明顯差異(P>0.05)；且以上指標(biāo)變化以LA-2組最顯著(P<0.05)，見表1。

表1 各組血液指標(biāo)檢測結(jié)果

2.4各組肝臟SOD活力、MDA含量比較 與對(duì)照組相比，模型組、LA-1組及LA-2組肝臟SOD活力顯著下降，MDA含量明顯升高(均P<0.01)；與模型組比較，LA-1組肝組織SOD活力有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)；LA-2組肝組織SOD活力顯著升高，MDA含量顯著下降(均P<0.01)。見表2。

2.5各組肝組織脂質(zhì)沉積及TNF-α水平比較 與對(duì)照組比較，模型組肝組織TC、TG、FFA含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，LA-1組TC、TG含量無明顯變化(P>0.05)，F(xiàn)FA含量顯著降低(P<0.01)；LA-2組TC、TG、FFA含量均顯著降低(P<0.01)。與對(duì)照組相比，其余3組肝組織TNF-α含量均明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，LA-1組及LA-2組均顯著下降，且LA-2組下降更明顯(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 各組肝臟指標(biāo)檢測結(jié)果

2.6肝組織TNF-α mRNA表達(dá) 與對(duì)照組(0.052±0.008)比較，模型組肝組織TNF-α mRNA表達(dá)(0.197±0.043)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，LA-1組及LA-2組(0.134±0.019、0.089±0.006)均顯著下降，且LA-2組下降更明顯(P<0.05,P<0.01)，見圖1。

1～4:對(duì)照組、模型組、LA-1組、LA-2組圖1 各組肝組織TNF-α mRNA表達(dá)

2.7肝組織切片 肝組織切片觀察顯示，對(duì)照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，所有動(dòng)物未顯示有肝組織病變跡象；模型組均存不同程度的脂肪變性，7只存在匯管區(qū)炎癥，6只出現(xiàn)輕度或中度肝細(xì)胞氣球樣變，4只出現(xiàn)肝纖維化；LA-1組5只存在輕度脂肪變性，3只出現(xiàn)匯管區(qū)炎癥，4只出現(xiàn)輕度肝細(xì)胞氣球樣變，2只出現(xiàn)肝纖維化；LA-2組1只存在輕度脂變，1只出現(xiàn)匯管區(qū)炎癥，2只出現(xiàn)輕度肝細(xì)胞氣球樣變。見圖2。

圖2 Wistar大鼠肝臟病理切片(HE，×200)

3 討 論

NAFLD的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，多種因素與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，隨著“二次打擊”學(xué)說的提出，氧化應(yīng)激在NAFLD發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸受到重視。氧化應(yīng)激是指反應(yīng)性氧及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生過多，或機(jī)體抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)故障，導(dǎo)致氧化和抗氧化體系失去平衡的狀態(tài)〔4〕。反應(yīng)性氧可直接造成肝細(xì)胞損傷，也可調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而影響某些基因表達(dá)，引起脂質(zhì)過氧化和慢性炎癥〔5〕。

α-LA是一種生物抗氧化劑，生物利用度高，抗氧化能力強(qiáng)。α-LA在體內(nèi)吸收后，可部分轉(zhuǎn)化為抗氧化活性更強(qiáng)的二氫硫辛酸(DHLA)，即單獨(dú)給予α-LA后，在體內(nèi)是以α-LA和DHLA兩種形式存在〔6〕。α-LA可有效清除羥基及一氧化氮自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧、次氯酸及過氧化亞硝基。雖然α-LA 不能清除超氧自由基過氧化物自由基，但DHLA對(duì)單線態(tài)氧以外的其他自由基均有清除作用。二者相互協(xié)作，上述所有自由基均可有效清除，從而發(fā)揮“萬能抗氧化劑”的作用〔7〕。目前α-LA的抗氧化應(yīng)激能力已被廣泛應(yīng)用于糖尿病領(lǐng)域，保護(hù)β細(xì)胞，延續(xù)β細(xì)胞衰減，減弱對(duì)β細(xì)胞的攻擊；保護(hù)肌肉、脂肪細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)葡萄糖的利用，增加胰島素敏感性；保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，治療糖尿病神經(jīng)病變；保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，防護(hù)動(dòng)脈粥樣硬化等〔8，9〕。

本研究通過高熱量飼料喂養(yǎng)成功建立大鼠NAFLD模型，結(jié)果顯示，α-LA治療對(duì)高熱量飼料引起的大鼠NAFLD有明確治療作用，表現(xiàn)為氧化應(yīng)激狀態(tài)改善、HI下降、血脂紊亂及肝臟脂質(zhì)沉積改善、血液及肝組織TNF-α表達(dá)降低。肝組織切片觀察也顯示，α-LA治療對(duì)該模型肝損傷有明顯改善作用，可顯著改善肝脂肪沉積、肝細(xì)胞氣球樣變、匯管區(qū)炎癥等病理特征，且α-LA對(duì)NAFLD的治療效果呈劑量依賴性。本研究結(jié)果為NAFLD的藥物治療提供了新的方向，也進(jìn)一步證明了氧化應(yīng)激在NAFLD發(fā)生發(fā)展中的重要性。