于智莘 呂宏亮 李晶 宋琳琳 粟栗 于江波

(1長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130117；2吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司)

失眠又稱入睡和維持睡眠障礙(DLMS)，臨床上以難于入睡、頻度過短、深度不足、早醒及睡眠質(zhì)量不佳、持續(xù)時間短等為主要癥狀的一種病證〔1〕。臨床上用于治療失眠的藥物主要以人工合成的鎮(zhèn)靜催眠的西藥制劑為主，通過縮短睡眠潛伏期，延長睡眠時間起到改善睡眠質(zhì)量的作用，但因其對大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)存在廣泛的抑制作用，長期服用極易產(chǎn)生成癮性和依賴性。中醫(yī)藥在治療失眠方面療效顯著，無成癮性、依賴性，無不良反應(yīng)及停藥反跳現(xiàn)象，且藥毒性及副作用少。安神補腦液(ASBN)具有安神健腦、生補精髓、涵養(yǎng)氣血之功效。本文通過建立失眠動物模型，觀察ASBN對失眠大鼠睡眠狀態(tài)的改善作用及該藥對模型大鼠海馬體內(nèi)γ-氨基丁酸受體(GABA)_ARα1、GABA、ARγ2、Na+-K+-Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(NKCC1)表達的影響，從而從海馬體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)受體及NKCC1表達的角度探索ASBN治療失眠的機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物及材料 SD大鼠90只購自遼寧省長生生物技術(shù)股份有限公司，動物合格證號：SCXK-(遼)2015-0001，9～11周齡，體重185～215 g，雄雌各半。KM昆明種小鼠20只購自遼寧省長生生物技術(shù)股份有限公司，動物合格證號：SCXK-(遼)2015-0001，10～12周齡，體重18～22 g，雄雌各半。

試劑：對氯苯丙氨酸(PCPA)(Sigma，USA)；合成PCR引物(Sangon Biotech上海)；戊巴比妥鈉(Sigma，USA)； UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒(Sangon Biotech，上海)；兔抗GABA_ARα1 (Protein Tech，USA) ，兔抗GABA_ARγ2(Protein Tech，USA) ，NKCC1(Protein Tech，USA) ； Trans Script Green Two-Stepq RT-PCRSuperMix(全式金生物技術(shù)，北京)；北京化工廠氯仿(CNNo.32061)；生理鹽水(四藥有限公司，石家莊，批號:H2015653)；MS104TS 電子天平(梅特勒-托利公司，瑞士)； 7500型Real-timePCR儀(ABI)。

1.2復制失眠模型〔2〕SD大鼠先進行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進行稱重，運用完全隨機分組法分為正常組(15只)和模型組(75只)，模型組腹腔注射PCPA混懸液，正常組腹腔注射等體積0.9%生理鹽水，連續(xù)注射2 d后觀察模型組及正常組狀態(tài)。將復制成功的失眠模型大鼠完全隨機分為模型組、ASBN-高劑量(H)組、ASBN-中劑量(M)組、ASBN-低劑量(L)組和氟西汀(Fluoxetine)組各15只。正常組和模型組連續(xù)7 d生理鹽水灌胃；Fluoxetine組：連續(xù)7 d Fluoxetine 1.5 mg/kg灌胃；ASBN-H組、ASBN-M組、ASBN-L組：連7 d ASBN 100、75、50 mg/kg灌胃。根據(jù)大鼠給藥體表面積公式計算出各用藥組大鼠的給藥劑量。

1.3探索戊巴比妥鈉睡眠劑量的閾值〔3～6〕該實驗首先通過入睡率確定戊巴比妥鈉睡眠劑量的閾值。入睡的評定標準：給藥30 min內(nèi)小鼠翻正反射消失>1 min。戊巴比妥鈉睡眠劑量閾上值評定標準：小鼠完全入睡，又不使睡眠時間過長的劑量；戊巴比妥鈉睡眠劑量閾下值評定標準：90%～100%小鼠翻正反射不消失的藥物最大劑量。經(jīng)過預實驗確定，小鼠戊巴比妥鈉睡眠劑量閾值為35～45 mg/kg。

測試前小鼠禁食12 h，稱取體重，計算每只小鼠注射戊巴比妥鈉的劑量。6組小鼠于第5天給藥30 min后，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉閾下值35 mg/kg，以小鼠翻正反射消失時間為指標，記錄30 min內(nèi)入睡小鼠百分率為入睡率。

1.4觀察指標 觀察大鼠精神，活動狀態(tài)，皮毛顏色，飲水、進食量及對外界刺激的反應(yīng)等。

1.5對戊巴比妥鈉閾下值大鼠入睡率的影響〔7～9〕ASBN-H、M、L組灌胃，模型組給予等劑量0.9%生理鹽水，灌胃結(jié)束后1 h，各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉閾下值35 mg/kg(臨用前現(xiàn)配)，F(xiàn)luoxetine組給予0.25 mg/kg Fluoxetine溶液，灌胃量0.01 ml/g。觀察并記錄給予戊巴比妥鈉后30 min內(nèi)各組大鼠入睡的數(shù)量(入睡評定標準：30 min內(nèi)翻正反射消失達1 min以上)。

1.6免疫組化染色(IHC)-P法檢測大鼠海馬體齒狀回GABA_ARα1的表達〔10，11〕取材：最后一次給藥1 h后，每組隨機取大鼠10只，雄雌各半，腹腔注射10%水合三氯乙醛〔CCl3CH(OH)2〕3 ml/kg進行麻醉，腹主動脈采血，10 min后，灌注大量生理鹽水沖洗至肝臟發(fā)白，流出液基本無色后灌注4%多聚甲醛，致全身僵硬，于10 min后斷頭取腦，放入4%多聚甲醛溶液中，置于4℃固定，取海馬段，常規(guī)石蠟包埋切片。IHC：60℃烤片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度入水，沖洗，抗原修復，內(nèi)源性過氧化物歧化酶封閉，加一抗1∶50工作液，2～8℃孵育過夜，生物素標記(兔抗GABA_Aα1)，室溫孵育，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加辣根過氧化物酶(HRP)標記的霉親和素室溫孵育，PBS 沖洗，DAB顯色，沖洗，蘇木素復染，鹽酸-乙醇分化，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下檢測。GABA_ARα1受體蛋白OD值檢測：使用Image Pro plus(IPP)7.0圖像分析軟件，檢測陽性細胞的積分OD值，每張切片選取5個視野，取平均值。

1.7qPCR〔6〕加入Trizol研磨大鼠海馬體腦組織，取上清液，依次加入CCl3、C2H5OH提取總RNA；根據(jù)總RNA濃度計算模板加樣量，使用RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，GABA_ARγ2正義鏈：5′-CTTCTTCGGATGTTTTCCTTCAGG-3′，反義鏈：5′-CATAGGGTATTAGATCGTTGGACT-3′，退火溫度60℃，NKCC1正義鏈：5′-TTACTACCTGCGCACCTTCG-3′，反義鏈：5′-TCCAGCTCATCGTGGAACTC-3′，退火溫度62℃，β-actin上游引物：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，退火溫度61℃。PCR擴增反應(yīng)條件：95℃ 10 min,95℃ 20 s,60℃ 60 s,擴增36～40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，讀取PCR軟件內(nèi)的循環(huán)閾值(CT值)，采用ΔΔCT法處理結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參計算GABA_ARγ2和NKCC1的相對表達量，以2-ΔΔCt表示。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.1軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1一般狀態(tài) 正常組精神狀態(tài)良好，活動敏捷，毛發(fā)光亮，體重明顯增加。模型組精神亢奮，易激惹，毛發(fā)干枯、無光亮，飲水量明顯增加，形體消瘦。Fluoxetine組和ASBN-H、M、L組精神狀態(tài)、活動情況均不同程度優(yōu)于模型組。

2.2戊巴比妥鈉閾下值催眠實驗 正常組入睡率為25%，與模型組(10%)比較，各劑量給藥組均能使戊巴比妥鈉閾下值30 min內(nèi)的入睡率增加(Fluoxetine組90%，ASBN-H、M、L組為74%、52%、40%；P<0.05)。

2.3ASBN對失眠大鼠模型海馬體組織中GABA_ARα1受體表達量的影響 在光學顯微鏡下可見，免疫組織化學切片的背景呈現(xiàn)淡黃色，免疫陽性細胞呈現(xiàn)不同程度的棕黃色，海馬體齒狀回GABA_ARα1受體呈現(xiàn)圓形、卵圓形及多角形，大小不一，細胞突起為 2～3個。結(jié)果顯示，模型組(0.030 2±0.009 6)與正常組(0.053 6±0.024 9)比較，大鼠海馬體齒狀回GABA_ARα1受體表達量明顯減少(P<0.05)。與模型組比較，F(xiàn)luoxetine組(0.052 1±0.030 7)顯著增加(P<0.01)，ASBN-H組(0.049 2±0.036 8)明顯增加(P<0.05)；ASBN-M組(0.047 7±0.029 6)、ASBN-L組(0.044 9±0.030 2)與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 各組海馬體齒狀回GABA_ARα1表達(IHC-P,×100)

2.4GABA_ARγ2和NKCC1 mRNA在失眠大鼠海馬體腦組織中的表達 各組GABA_ARγ2 mRNA表達差異顯著(P<0.05)；模型組較正常組明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，F(xiàn)luoxetine組、ASBN-H組明顯增高(P<0.05)。各組NKCC1 mRNA表達無明顯差異(P>0.05)，但模型組表達呈升高趨勢，且各用藥劑量組都呈現(xiàn)降低趨勢，見表1。

表1 各組海馬體GABA_ARγ2、NKCC1 mRNA 表達比較

3 討 論

睡眠是人體最基本的生理功能，既重要又復雜，涉及中樞系統(tǒng)的多個部位，且受到多種因子的影響。目前已知的部位涉及腦干、下丘腦、皮質(zhì)、海馬區(qū)等多個腦區(qū)，涉及的因子主要有神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細胞因子、肽類物質(zhì)等。經(jīng)過長期研究表明，海馬與人體睡眠關(guān)系密切。其中海馬體〔9〕內(nèi)GABA_ARα1、GABA_RA、γ2、NKCC1可作為研究失眠機制的重要依據(jù)。GABA_AR藥理學研究集中在BDZ位點上，通過結(jié)合GABA_AR上一個特異的識別位點(α1)，進而增加Cl-通道的開放頻次，使Cl-內(nèi)流，細胞膜超極化，產(chǎn)生具有抑制性的突觸后電位，從而增強對GABA的抑制作用。本實驗以此作為選取GABA_ARα1、GABA_AR、γ2作為觀察指標的理論支撐〔10〕。

本研究結(jié)果表明，ASBN對改善失眠大鼠睡眠節(jié)律有一定作用，其作用機制可能是提高大鼠海馬體中GABA_ARα1和 GABA_ARγ2，減少NKCC1，從而起到治療作用。