李晶 蘇帆 林芷伊 費晶 徐丹 鞏平

(1石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內科，新疆 石河子 832000；2萊西市人民醫(yī)院)

在世界范圍內肺癌生存率僅為15%〔1〕。非小細胞肺癌(NSCLC)作為癌癥相關死亡的最常見原因，約占所有肺癌病例的80%〔2〕。順鉑是一種鉑合成復合物，被廣泛用作NSCLC治療的一線化療藥物〔3〕。但是，重復化療使一些腫瘤產生了耐藥性，最終導致復發(fā)和預后不良，這使得順鉑的臨床療效受到嚴重限制〔4〕。因此，發(fā)現(xiàn)無嚴重不良反應的新方法改善化療、減少化療耐受具有重要意義〔5，6〕。腫瘤的發(fā)病機制與細胞凋亡密切相關。從人紅系白血病細胞(TF-1)發(fā)生凋亡時克隆而來的TF-1 apoptosis-related基因(TFAR)19，在細胞凋亡中起著至關重要的作用。在TFAR19被國際人類基因提名委員會(加入基因庫號：AF014955)指定為程序性細胞死亡因子(PDCD)5之前，首先被Liu等〔7〕于1999年在北京大學人類疾病基因組學中心報道。PDCD5在包括肺癌在內的多種人類腫瘤中表達都降低〔8〕。重組人PDCD5 (rhPDCD5)蛋白通過網格蛋白獨立的內吞作用進入細胞，促進細胞凋亡活性〔9〕。這說明rhPDCD5不僅使軟骨肉瘤〔10〕、肝癌細胞對順鉑化療敏感〔11〕，而且還使K562細胞對去甲氧柔紅霉素(IDR)和阿糖胞苷(Ara-C)化療敏感。本研究觀察rhPDCD5對肺癌細胞對順鉑的化療敏感性的影響，為提高順鉑的抗腫瘤效果提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 順鉑購自濟南齊魯藥業(yè)公司(中國濟南)，并根據(jù)需要在無菌鹽水中制備新鮮稀釋液。rhPDCD5蛋白由北京生物海洋技術有限公司(中國北京)提供。PDCD5蛋白的內毒素活性超過10 EU/mg，使用鱟變形細胞裂解液檢測，純度為95%〔12〕。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自Usen Science Inc.(中國武漢)；人肺腺癌細胞系A549購自中國科學院細胞庫(中國上海)。

1.2細胞培養(yǎng)與分組 A549細胞株培養(yǎng)在含10%胎牛血清(BSA)、青鏈霉素混合液(100×)的RPMI1640培養(yǎng)液中，放置于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3ELISA檢測PDCD5細胞中蛋白水平 細胞在6孔板(每孔4×104個細胞)中生長24 h，然后用順鉑(順鉑組)、順鉑+rhPDCD5 15 μg/ml(rhPOCD5A組)、順鉑+rhPDCD5 30 μg/ml(rhPDCD5 B組)處理，將磷酸鹽緩沖液(PBS)用作對照組。處理24 h后，用胰蛋白酶分離貼壁細胞，然后通過離心收集。然后將細胞在冷PBS中洗滌3次。將重懸的PBS(1×)細胞進行超聲波處理4次，在4℃下1 500 r/min離心10 min。向每個孔中加入100 μl樣品，將細胞在37℃下溫育2 h。在抽吸和添加100 μl制備的檢測試劑A之前，在37℃下進行第2次溫育1 h。然后吸出并洗滌3次。再加入制備的100 μl檢測試劑B，在37℃下孵育30 min，然后吸出并洗滌5次。隨后加入90 μl底物溶液，在37℃下孵育25 min。最后，添加50 μl終止液并立即用酶標儀讀取450 nm波長處OD值。每次處理均重復3次。

1.4MTT比色法檢測增殖 采用MTT法測定細胞增殖。細胞生長在96孔板(2×103個細胞)24 h，加藥同1.3，加藥后12 h、24 h、36 h分別檢測細胞增殖抑制率，加入5 mg/ml MTT試劑20 μl，置于暗處培養(yǎng)4 h。酶標儀在490 nm參比(BioRad Lab Technologies，USA)的波長下測量平板的吸光度。結果表示為相對于未處理對照的吸光度百分比，每次處理均重復3次。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 將A549細胞接種在6孔板(4×105個細胞)中培養(yǎng)24 h。細胞經順鉑和(或)rhPDCD5處理并培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶分離黏附細胞，離心收集。然后將細胞在冷PBS中洗滌3次，再懸浮在100 ml的結合緩沖液中。根據(jù)說明書(中國杭州聯(lián)科生物)添加FITC耦聯(lián)的AnnexinV和碘化丙啶(PI)。暗處室溫下處理20 min，加入400 ml結合緩沖液。立即在流式細胞儀(FACSAria，Becton Dickinson，USA)上對樣品進行分析。實驗結果重復3次。

1.6樣本 本研究經石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤科倫理委員會批準，參與者均簽署書面知情同意書。招募了2013年1月至2014年1月石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內科收治的NSCLC患者。收集肺癌患者外周血標本(男13例，女27例，年齡30～79歲，中位年齡60.5歲)。使用中位數(shù)將患者分為PDCD5高表達組和PDCD5低表達組，給予鉑類藥物與其他化療藥物用于化療。治療周期為21 d，包括4個周期。樣本采集前患者均未接受化療、放療、手術治療或生物治療。患者的診斷均為活檢所證實。治療前影像學研究，采用美國癌癥分期系統(tǒng)聯(lián)合委員會〔13〕進行組織學分級，臨床分期按照TNM標準〔14〕進行。將樣本凝結30 min，然后離心10 min，將所有樣本冷凍儲存在-80℃，直到試驗。

1.7ELISA法檢測血清PDCD5蛋白表達 用ELISA試劑盒測定患者血清中PDCD5蛋白的表達。設立空白孔、標準品孔和樣本反應孔。以標準品稀釋溶液作為空白。37℃下培養(yǎng)2 h，然后抽吸和添加100 μl制備的檢測試劑A并在37℃溫育1 h，將其吸出并洗滌3次。接下來加入100 μl制備的檢測試劑B并在37℃下溫育30 min，然后吸出并洗滌5次。隨后加入90 μl底物溶液，在37℃溫育25 min。最后，添加50 μl終止液，立即讀取450 nm波長處的OD值。

1.8統(tǒng)計學方法 使用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、Pearson分析、χ2檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度的PDCD5蛋白處理后A549細胞中PDCD5蛋白表達上調 隨著rhPDCD5蛋白濃度的增加，PDCD5蛋白表達在A549細胞中表達上調，對照組、順鉑組、rhPDCD5 A組、rhPDCD5 B組PDCD5蛋白表達分別為：(0.269±0.000)pg/ml、(0.111±0.002)pg/ml、(0.123±0.009)pg/ml、(0.157±0.009)pg/ml，差異有統(tǒng)計學意義(F=284.321，P<0.001)。

2.2rhPDCD5增強順鉑誘導的A549細胞生長停滯 與順鉑組相比，rhPDCD5 A組和B組增殖抑制率顯著更高，且這種效應呈劑量和時間依賴性。見表1。

表1 rhPDCD5增強順鉑誘導的A549細胞的增殖抑制率

2.3順鉑處理后rhPDCD5蛋白促進A549細胞凋亡 各組細胞凋亡率分別為：對照組(6.56±0.49)%，順鉑組(22.31±0.64)%，rhPDCD5 A組(43.30±0.62)%，rhPDCD5 B組(64.25±0.54)%，各組細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(F=1 908.87，P<0.001)。不同劑量PDCD5(15和30 μg/ml)與順鉑聯(lián)合應用細胞凋亡率協(xié)同增加，并且呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 rhPDCD5促進順鉑誘導的A549細胞凋亡

2.4PDCD5蛋白存在于NSCLC患者中 PDCD5蛋白表達與年齡或性別無顯著相關性，但與吸煙、TNM分期和淋巴結轉移顯著相關。

2.5rhPDCD5蛋白增強了NSCLC患者順鉑的抗腫瘤活性 對于鉑類化療藥物，較高的表達效率為80%(16/20)，而較低的表達效率為45%(9/20)，差異具有統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 根據(jù)臨床病理學特征和小細胞肺癌患者的治療效果的PDCD5蛋白的表達(n)

3 討 論

NSCLC治療方案的選擇取決于疾病的階段、表現(xiàn)狀態(tài)。對于晚期患者來說，化療可能是唯一可選的治療方式。盡管對順鉑耐藥性的改善是NSCLC患者長期治療需要克服的重要的障礙〔4〕，順鉑仍是NSCLC患者最有效的治療方法之一，增強NSCLC細胞對順鉑敏感性的因素可能會突出治療的預測性生物標志物或靶點。

PDCD5在細胞凋亡和細胞周期中起重要作用。據(jù)報道〔14〕，健康肺組織中的PDCD5蛋白表達量高于肺癌組織。研究發(fā)現(xiàn)，PDCD5過表達可誘導肺癌細胞系A549凋亡〔15〕。此外，在培養(yǎng)基中加入外源性rhPDCD5可以增強由硫酸肝素蛋白多糖結合和脂筏引發(fā)的網格蛋白獨立內吞通路引起的程序性細胞死亡〔9〕。在本研究中，外源性添加不同濃度的rhPDCD5到A549培養(yǎng)基中，可以增加PDCD5蛋白的表達。本研究發(fā)現(xiàn)PDCD5蛋白可以改變腫瘤的生物學行為，提高A549細胞對順鉑的體外敏感性。有報道稱PDCD5基因和PDCD5蛋白可增強胃癌細胞〔16〕、骨肉瘤細胞〔17〕、軟骨肉瘤細胞〔10〕、乳腺癌細胞〔18〕、慢性粒細胞白血病細胞〔19〕、膠質瘤細胞〔20〕、肝癌細胞〔21〕對化療的敏感性等。

本研究中，PDCD5蛋白在NSCLC中的表達降低與年齡、性別無關，與吸煙行為、TNM分期、淋巴結轉移有關。有報道稱PDCD5表達與年齡、性別無顯著關系，但與人胃腸道間質瘤患者的腫瘤大小及有絲分裂有顯著相關性〔22〕。在肝癌患者中，PDCD5的表達與乙肝病毒(HBV)感染、腫瘤數(shù)量、淋巴結轉移、生存時間有顯著相關性〔23〕。Xu等〔24〕在喉癌鱗狀細胞癌中的報道表明，PDCD5的表達與年齡、性別、原發(fā)或淋巴結轉移部位無顯著相關性。

本研究發(fā)現(xiàn)PDCD5蛋白低表達與不良療效呈正相關。事實上，在膠質瘤〔25〕、前列腺癌〔26〕、上皮性卵巢癌〔27〕、軟骨肉瘤〔28〕患者中，PDCD5低表達與預后不良呈正相關。由于后續(xù)治療的差異，僅觀察到4個化療周期后的療效。

綜上所述，本研究首次證實rhPDCD5對順鉑誘導的細胞毒性具有明顯的致敏作用。高表達PDCD5蛋白的肺癌患者可能更適合采用以順鉑為基礎的化療。PDCD5有可能用于改善肺癌患者對順鉑化療的反應，但尚需進一步的研究證實。