徐則林 陳新宇 陳青揚 吳治諺 蔡虎志

(1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2江門五邑中醫(yī)院)

慢性心力衰竭(CHF)由冠心病、高血壓、心臟瓣膜病、擴心病等各類原發(fā)心臟疾病發(fā)展至后期所致，臨床以體液潴留為主要體征，以胸悶乏力、呼吸困難、活動受限為主要表現(xiàn)〔1～3〕。課題組長年從事CHF的中醫(yī)藥防治工作，前期研究證實絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)四大亞型中與炎性刺激密切相關(guān)的P38MAPK亞型與CHF的發(fā)展密切相關(guān)，且P38MAPK的蛋白磷酸化程度隨著CHF的進(jìn)展也顯著上調(diào)，溫陽振衰顆粒可以抑制P38MAPK蛋白磷酸化的過度表達(dá)〔4〕。作為P38MAPK的上游非編碼基因，LncRNA BIC/miR-155能通過MAPK激酶(MKK)-3及MKK-6通路直接調(diào)控P38MAPK mRNA的表達(dá)〔5,6〕。本研究擬進(jìn)一步闡釋溫陽振衰顆粒是否通過LncRNA BIC/miR-155調(diào)控P38MAPK進(jìn)而對CHF產(chǎn)生治療作用。

1 材料與方法

1.1動物 40只SD健康SPF級實驗大鼠由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供〔SCXK(湘)2014-002〕，所有實驗大鼠自由飲食，設(shè)置光/暗周期為12 h/12 h，背景噪音控制在(40±10)dB，飼養(yǎng)1 w適應(yīng)環(huán)境。

1.2主要藥物與試劑 P38抗體購自武漢博士德生物公司(BA1325-2)，p-P38抗體購自北京博奧森生物科技公司(bs-2210R)，SYBR Green PCR試劑盒由美國Thermo公司(K0223)提供，溫陽振衰顆粒由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(201606)提供，依那普利由山東辰欣藥業(yè)股份有限公司提供(H20083605)，鹽酸阿霉素(ADR)由深圳萬樂藥業(yè)有限公司提供(201708)。

1.3CHF模型建立 將ADR用生理鹽水配置為2.0 mg/ml，按1.5 ml/kg進(jìn)行大鼠腹腔注射造模，每周1次，連續(xù)6 w，每次注射前均重新測量體重，以此作為注射劑量的依據(jù)〔5〕。

1.4分組 從40只實驗大鼠中隨機抽取30只使用ADR進(jìn)行造模，余10只為正常對照組。在第3次注射ADR后6 d對所有實驗大鼠行心臟彩超檢查，根據(jù)彩超結(jié)果進(jìn)行分層，再使用隨機區(qū)組設(shè)計將30只實驗大鼠分為模型對照組、溫陽振衰組及陽性對照組〔4〕。

1.5給藥方法 自第3次注射ADR后7 d開始，溫陽振衰組用溫陽振衰顆粒按1.44 g/(kg·d)進(jìn)行灌胃，2次/d，3 ml/次，連續(xù)灌胃4 w。陽性對照組使用依那普利按1.8 mg/(kg·d)進(jìn)行灌胃，每天灌胃2次，每次3 ml，連續(xù)4 w。正常對照組用生理鹽水進(jìn)行灌胃，每天2次，每次3 ml，連續(xù)4 w〔4〕。

1.6心臟彩超檢查 選擇左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)、左室收縮末內(nèi)徑(LVSD)、左室舒張末內(nèi)徑(LVDD)5個心臟彩超常用指標(biāo)作為檢查指標(biāo)，取5個心動周期求平均值。

1.7Western印跡檢測 取心肌組織總蛋白50 μg并加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，在100℃環(huán)境中持續(xù)變性8 min后，使用16 mA/gel恒定電流電泳15 min，再修改為32 mA/gel恒定電流電泳至底部。按膜面積0.8 mA/cm2設(shè)定恒定電流進(jìn)行電轉(zhuǎn)印，加入一抗并在4℃環(huán)境中過夜后加入酶標(biāo)二抗，在室溫中雜交2 h。TBST漂洗3次，每次10 min，后ECL曝光顯像，掃描，保存，分析。

1.8RT-PCR檢測 從液氮罐中取出保存的實驗大鼠心肌組織，登錄NCBI基因庫并從中查詢LncRNA BIC、miR-155和P38MAPK的基因序列，根據(jù)相應(yīng)引物序列設(shè)計引物，嚴(yán)格按照PCR反應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量RT-PCR分析。LncRNA BIC-上游引物：CTATCAGTGGCTACCAACC，下游引物：AACAGTTACACAGCCTTCA ，長度101 bp；miR-155-上游引物：GGGTTAATGCTAATTGTG，下游引物：AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC，長度61 bp；P38MAPK-上游引物：TGCCTTCCTCTACTCCAT，下游引物：TAGCCAGAAAGTCCATCA，長度98 bp；內(nèi)參U6-上游引物：GCTTCGGCACGTAACATATACTAAAAT，下游引物：CGCTTCACGACCTAGTGCGTGTCAT，長度89 bp。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD法、TamhaneT2法。

2 結(jié) 果

2.1實驗后各組心功能LVEF、LVFS的變化 各實驗組LVEF、LVFS較正常對照組顯著降低(P<0.05)，藥物干預(yù)兩組LVEF、LVFS較模型對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中溫陽振衰組效果改善LVEF效果最為顯著，與陽性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2實驗后各組心功能LVSD、LVDD比較 各實驗組LVSD、LVDD較正常對照組顯著增高(P<0.05)，藥物干預(yù)兩組LVSD、LVDD較模型對照組有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，溫陽振衰組與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組心功能LVEF、LVFS、LVSD、LVDD及心肌P38MAPK與p-P38MAPK表達(dá)比較

2.3各組心肌p-P38MAPK與P38MAPK的表達(dá) 各實驗組心肌p-P38MAPK表達(dá)較正常對照組顯著升高(P<0.05)。溫陽振衰組上調(diào)程度較陽性對照組更緩，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，各組心肌P38MAPK表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖1。

1～4:正常對照組、模型對照組、溫陽振衰組、陽性對照組圖1 各組心肌P38MAPK與p-P38MAPK的表達(dá)

2.4各組心肌LncRNA BIC、miR-155及P38MAPK mRNA的表達(dá) 實驗后各實驗組心肌LncRNA BIC和miR-155表達(dá)明顯低于正常對照組(P<0.05)。溫陽振衰組下調(diào)程度最為緩慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，各組心肌P38MAPK mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖2。

表2 各組心肌LncRNA BIC、miR-155及P38MAPK mRNA的表達(dá)

圖2 各組心肌LncRNA BIC、miR-155及P38MAPK mRNA的表達(dá)

3 討 論

細(xì)胞是組成生命的基本結(jié)構(gòu)，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能改變都是以一系列細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為基礎(chǔ)。MAPK是機體應(yīng)激反應(yīng)、炎性刺激、血管生成、凋亡誘導(dǎo)的信號通路反應(yīng)中樞，P38MAPK是MAPK家族中的四大亞族之一，是介導(dǎo)細(xì)胞炎性反應(yīng)的主要信號通路蛋白。P38MAPK被上游調(diào)控基因或環(huán)境相關(guān)因素刺激激活后，可以通過磷酸化修飾進(jìn)而激活多種轉(zhuǎn)錄因子，形成心肌細(xì)胞的級聯(lián)式炎性瀑布反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷〔7，8〕。miR-155屬于短鏈非編碼RNA，雖然不具備傳統(tǒng)中心法則編碼蛋白質(zhì)的功能，但可通過影響MKK-3及MKK-6從而對P38MAPK的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而影響P38MAPK的蛋白磷酸化表達(dá)量。在心血管系統(tǒng)疾病領(lǐng)域，miR-155有廣泛的調(diào)控作用，有報道顯示過表達(dá)miR-155可以顯著增加心肌干細(xì)胞移植成功率，且上調(diào)miR-155可以對炎性因子白細(xì)胞介素(IL)-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α有明顯的抑制作用〔9～13〕。作為miR-155的直接編碼基因LncRNA BIC，人類LncRNA BIC于2001年被發(fā)現(xiàn)，而大鼠的LncRNA BIC直到2015年11月15日才正式上傳至NCBI基因數(shù)據(jù)庫，因此，LncRNA BIC調(diào)控miR-155進(jìn)而影響P38MAPK這條信號通路極具研究價值。

溫陽振衰顆粒由湖南省名中醫(yī)陳新宇教授創(chuàng)制，該中藥復(fù)方由附子、干姜、甘草、紅參等六位中藥組成。方中君藥附子具有溫補腎陽，扶陽破陰，一掃陰霾之功；紅參具有回陽救逆，復(fù)脈固脫，振奮心陽之效〔14〕。炙甘草調(diào)和諸藥，亦兼補土功效，需知“火得土覆方可久存”〔15〕。前期課題組證實了P38MAPK的蛋白磷酸化程度與CHF的發(fā)展呈顯著正相關(guān)性，溫陽振衰顆粒可以抑制P38MAPK蛋白磷酸化的過度表達(dá)〔4〕。本研究結(jié)果說明，LncRNA BIC和miR-155的高表達(dá)對心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，且LncRNA BIC/miR-155可能通過調(diào)控P38MAPK的蛋白磷酸化從而介導(dǎo)炎性反應(yīng)，溫陽振衰顆粒有可能通過上調(diào)心肌細(xì)胞中LncRNA BIC/miR-155的表達(dá)進(jìn)而抑制P38MAPK蛋白過度磷酸化后介導(dǎo)的炎性因子對心肌細(xì)胞的損傷作用，這可能是溫陽振衰顆粒治療CHF的重要分子機制之一。