葉偉華，李杰峰

(1.松陽縣綠谷精耕園家庭農(nóng)場，浙江 麗水 323400； 2.浙江農(nóng)藝師學(xué)院, 浙江 杭州 310021；3.松陽縣自然資源和規(guī)劃局，浙江 麗水 323400)

嘉茗1號(烏牛早)原產(chǎn)于浙江省永嘉縣，1988年通過省級品種認(rèn)定，屬于無性繁育系特早芽種，適制綠茶[1]，后被松陽縣引進用于山地茶園種植，但是山地茶園海拔不同，氣候條件差異很大，對茶葉的生產(chǎn)與產(chǎn)品品質(zhì)有影響。其中，濕度變化對茶葉品質(zhì)的影響最大，茶園海拔每上升100 m，年平均濕度上升3.65%。春季氣溫上升緩慢，茶葉的物候期延遲，春梢萌芽和茶葉的采摘期等隨海拔上升而延遲。在一定海拔下，茶葉產(chǎn)量隨海拔上升而降低，但茶葉品質(zhì)隨海拔上升而提高[2]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于海拔與生態(tài)因子對茶葉品質(zhì)的影響已有報道。舒慶齡等[2]研究表明，海拔500 m以上的成茶品質(zhì)明顯優(yōu)于海拔200 m以下的茶葉。汪春園等[3]研究表明，山區(qū)低溫導(dǎo)致茶梢生長緩慢是形成高山茶香的主要原因。然而茶葉品質(zhì)不是海拔越高越好，隨著海拔的升高，茶葉中游離氨基酸總量和可溶性糖含量出現(xiàn)了下降情況，結(jié)合其他營養(yǎng)成分的變化，過高的海拔不利于形成優(yōu)質(zhì)茶葉，最佳海拔根據(jù)當(dāng)?shù)貧夂虻牟煌兴兓痆4]。李永菊等[5]研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)質(zhì)茶葉的形成并不由某一個成分所決定，也不只受一項指標(biāo)的影響，而是地理環(huán)境、海拔、茶樹品種等共同作用的結(jié)果。

本文研究松陽縣不同海拔茶葉的主要營養(yǎng)成分和抗氧化性能差異，旨在探明茶葉品質(zhì)與海拔的關(guān)系，改進其品質(zhì)風(fēng)味，進一步提高質(zhì)量，為茶樹栽培育種和合理開發(fā)茶園提供必要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏牛早鮮葉(一芽二葉)于2018年春季采自麗水市松陽縣3處產(chǎn)茶基地，海拔分別為150～300、300～500、500～700 m，每個海拔區(qū)間采樣6個。按照相同的工藝加工制得松陽香茶。

草酸、乙醇、濃硫酸均為分析純(AR)，磷酸鹽緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液、福林酚試劑、3,5-二硝基水楊酸(純度>99%)均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司；異硫氰酸苯酯(純度>97%)、氨基酸、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品為美國sigma公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈為色譜純，為美國TEDIA公司產(chǎn)品；2,6-二氯靛酚(純度>97%)購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DFT-200手提式高速粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)，TP-214電子天平(DENVER)、RC實驗室用離心機(上?；C械廠有限公司)，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，T6新世紀(jì)紫外可見光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，LC20A高效液相色譜(HPLC)[Q2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)]，手動固相微萃取(SPME)進樣器配PDMS/DVB萃取頭(日本島津儀器公司)。

1.3 方法

1.3.1 營養(yǎng)成分測定

水浸出物含量的測定參照GB/T 8305—2013《茶水浸出物測定》，茶多酚含量的測定方法參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》，蛋白質(zhì)含量的測定參照GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》，VC含量采用2,6-二氯靛酚滴定法測定，總黃酮含量采用三氯化鋁比色法[6]測定。

氨基酸的測定采用異硫氰酸苯酯柱前衍生-高效液相色譜法(PITC-HPLC)，根據(jù)氨基酸對照品的保留時間與待測樣品中相應(yīng)組分的保留時間進行定性分析，外標(biāo)法定量分析[7]。

樣品衍生化：取0.25 mL標(biāo)準(zhǔn)液或經(jīng)離心的茶葉上清液，加入0.75 mL的高純水，加入含0.5 mL 14%三乙胺的乙腈溶液和含0.5 mL 1.2%異硫氰酸苯酯的乙腈溶液，搖勻，室溫下靜置60 min。反應(yīng)完全后3 000g離心5 min，取上清液加入2 mL正己烷萃取，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾后進樣。流動相與洗脫程序見表1。

表1 氨基酸分析梯度洗脫程序

1.3.2 香茶香氣成分的測定

稱取0.3 g(精確至0.001 g)磨碎的茶葉干樣，置于頂空瓶中，加入10 mL沸水(超純水)，保鮮膜封口，70 ℃固相微萃取30 min，GC-MS進樣分析，進樣口250 ℃解析15 min[8]。

GC-MS條件：Wax色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度為250 ℃，柱溫40 ℃，程序升溫為40 ℃保存5 min，以5 ℃·min-1升至250 ℃，保持5 min；流速1.0 mL·min-1；進樣方式為不分流；載氣為He；EI源，電子能量70 ev；離子源溫度230 ℃；掃描范圍33～650 nm。

定性定量分析方法采用NIST08和NIST08s標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫進行檢索定性，并用峰面積歸一法分析各成分相對含量。

1.3.3 香茶抗氧化性能的測定

Fe3+還原力的測定參照Apáti等[9]的方法，F(xiàn)e2+金屬螯合力的測定參照Dinis等[10]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用GraphPad 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔茶葉的主要營養(yǎng)成分

能溶于熱水的物質(zhì)被稱為水浸出物。茶葉中水浸出物的主要成分有茶多酚、氨基酸、可溶糖、可溶蛋白、咖啡堿、水溶色素、水溶性果膠、維生素和無機鹽等，茶葉中水浸出物含量一般為30%～48%[11-13]。由圖1可知，不同海拔茶葉中水浸出物的含量差異不顯著，可見海拔變化對茶樣品水浸出物的含量影響較小。

*、**分別表示差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)，ns表示差異不顯著。

茶多酚是多羥基酚類衍生物的總稱，包括兒茶素(黃烷醇類)、花青素、花白素類、黃酮、黃酮醇類、酚酸類等成分，其含量占茶葉干質(zhì)量的18%～36%[14]，茶多酚是茶葉的特征性物質(zhì)，是決定茶湯濃醇度、收斂性的主要物質(zhì)[15]。隨海拔的增加，茶葉中茶多酚含量呈顯著性下降趨勢。相較于150～300 m海拔綠茶的茶多酚含量，500～700 m海拔所產(chǎn)綠茶中茶多酚下降了28.6%。茶園區(qū)域的氣候隨海拔升高而改變，在高海拔地區(qū)陰霧天時，大霧繚繞，濕度大，促進了茶樹鮮葉營養(yǎng)循環(huán)，提高了酶活性，有利于含氮化合物的合成；晴天時，茶樹受到較多較強的漫射光作用，光合強度增大，茶樹基部長期陰濕，有利于含氮化合物的合成積累[16]。在溫度高、日照強的環(huán)境中，茶多酚含量有升高的趨勢。因此，適當(dāng)增加溫度和日照可以促進茶多酚的合成代謝。但當(dāng)海拔超過800 m時，溫度起主導(dǎo)作用，即溫度降低對茶多酚的合成抑制大于日照增加對其的影響，這是高海拔茶葉中多酚類物質(zhì)含量低的生理原因[17]。

茶葉樣品中蛋白質(zhì)的含量隨海拔的升高變化不顯著，海拔500～700 m的茶葉中蛋白質(zhì)含量最高達(dá)到31.47%，海拔150～300 m的茶葉樣品中蛋白質(zhì)含量最低，為29.41%。蛋白質(zhì)含量的變化是海拔、地理環(huán)境、茶樹品種等共同作用的結(jié)果。不同海拔茶葉中VC含量差異顯著，隨著海拔的升高，VC含量顯著上升。海拔500～700 m所產(chǎn)綠茶每100 g鮮質(zhì)量中VC為219.56 mg，比海拔150～300 m所產(chǎn)綠茶中VC含量上升了19.5%。茶樣中總黃酮含量隨海拔升高無顯著變化，海拔150～300 m的茶葉樣品中總黃酮含量達(dá)到11.06%，海拔500～700 m的茶葉樣品中總黃酮含量為10.61%。

茶葉中的氨基酸，一部分參與茶樹的蛋白質(zhì)和一些生理活性物質(zhì)的合成，一部分以游離狀態(tài)存在于細(xì)胞中。氨基酸與茶葉品質(zhì)有顯著相關(guān)性，氨基酸的組成和含量，以及次生代謝產(chǎn)物和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物直接影響茶葉的品質(zhì)，尤其是一些氨基酸與茶葉等級、茶湯滋味和香氣密切相關(guān)[18]。茶葉中游離氨基酸含量隨著海拔的升高而增多(表2)。海拔500～700 m的茶葉樣品中總游離氨基酸量最高，達(dá)到1 951.64 mg·kg-1，比海拔150～300 m的茶葉高了19.7%。在17種游離氨基酸中，天冬氨酸和谷氨酸在海拔500～700 m茶葉中的含量相對較高，分別比海拔150～300 m茶葉高19.0%、14.7%。谷氨酸和乙胺是茶氨酸生物合成的底物[4]。茶樹是一種喜銨類植物，耐銨性較強，茶樹可以通過谷酰胺合成酶——谷酰胺α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶系充分利用氮，從而提升茶葉品質(zhì)。茶葉中苯丙氨酸含量隨海拔升高呈先升高后降低的趨勢，海拔300～500 m茶葉中苯丙氨酸含量最高。茶葉樣品中胱氨酸、蛋氨酸含量在高海拔地區(qū)含量較高，因其結(jié)構(gòu)中含有硫，在加工過程中可以轉(zhuǎn)變成為二甲硫等揮發(fā)性香氣物質(zhì)，有利于高山茶葉的香氣形成。

表2 不同海拔茶葉中的游離氨基酸含量 單位：mg·kg-1

2.2 香氣成分的測定與分析

香氣是影響綠茶品質(zhì)的重要內(nèi)質(zhì)因子[19]，目前茶葉中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了700多種芳香物質(zhì)[20]。芳香物質(zhì)的組成極為復(fù)雜，大致可分為11類：碳?xì)浠衔?、醇類、醛類、酮類、酯類、?nèi)酯類、酚類、羧酸類、含硫化合物、含氧化合物和含氮化合物，含量占茶葉干物質(zhì)量的0.03%～0.05%[21]。本研究采用GC-MS測定茶葉中的香氣成分，篩選得到26種主要香氣成分，包括12種醇、4種酯、4種烷、2種烯和4種其他類化合物(表3)。不同海拔茶葉中香氣成分種類和含量皆差異顯著，海拔300～500 m的茶葉香氣成分種類最多，為21種，海拔150～300 m和500～700 m所產(chǎn)綠茶分別鑒定出19種、15種。從所屬類別看，茶葉香氣成分主要是醇類、酮類、酯類、醛類、酸類、酚類和碳?xì)浠衔铩?50～300、300～500、500～700 m海拔的茶葉香氣成分中碳?xì)浠衔锖克急壤謩e為28.50%、20.66%、13.99%，酮類含量所占比例分別為0、6.29%、5.12%，醛類含量所占比例分別為2.12%、2.86%、5.32%。隨著海拔的升高，茶葉香氣成分中碳?xì)浠衔锖克急壤陆?，酮類和醛類含量所占比例升高?/p>

表3 不同海拔綠茶的香氣成分比較

具有玫瑰香氣的壬醛在海拔150～700 m處均有檢出，且在海拔500～700 m含量最高，為1.08%。海拔150～500 m茶葉中檢測出具有微弱蘋果香的苯甲醇和具有較持久、柔和玫瑰香氣的苯乙醇，而海拔500～700 m的茶葉中均未檢出這2種化合物。沸點較高的萜稀醇類具有花香、果香，對茶香的形成具有較大的貢獻(xiàn)作用[20]。其中，橙花叔醇作為花香型名優(yōu)綠茶的主要香氣成分，在海拔150～500 m處的茶葉中均有檢出，且隨著海拔升高而降低。具有花香、木香的芳樟醇在不同海拔的茶葉中均有檢出，且在海拔為300～500 m時含量最高；芳樟醇主要是在茶葉干燥過程中形成，對茶葉良好香氣的形成具有重要作用。呈強烈彌散性水果香味的己酸、葉醇，具有青草香的α-法呢烯在海拔150～300、300～500 m的茶葉中均有檢出，且在150～300 m海拔處含量最高。酮類化合物常伴有花果香味，如具有紫羅蘭香的β-紫羅蘭酮，是綠茶中重要的芳香物質(zhì)，在海拔300～500、500～700 m均有檢出，在海拔300～500 m茶葉中含量最高，在海拔150～300 m茶葉中未檢出。

2.3 不同海拔綠茶抗氧化性能分析

不同海拔綠茶的抗氧化性能顯著差異(圖2)，還原力隨海拔的升高而降低，當(dāng)海拔在0～500 m時，還原力無明顯變化，海拔超過500 m時，還原力顯著降低。而螯合力隨著海拔的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在海拔300～500 m達(dá)到最大，為8.12 mg·g-1EDTA當(dāng)量?？偟膩碚f，海拔的變化顯著影響茶葉的抗氧化性能，隨著海拔的升高，抗氧化性能先升高后降低。因為隨著海拔的升高，維生素C含量逐漸增多，但茶多酚、黃酮等含量逐漸降低，多種抗氧化物質(zhì)共同作用使茶葉的抗氧化性能隨著海拔的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

圖2 不同海拔綠茶的抗氧化性能

3 小結(jié)

在烏牛早制得的香茶中，海拔對茶葉中氨基酸含量、VC含量和抗氧化性能有顯著影響，對水浸物、蛋白質(zhì)含量、總黃酮含量無顯著影響；隨著海拔的升高，茶葉香氣成分中碳?xì)浠衔锖克急壤陆?，酮類和醛類含量所占比例升高，高海拔的茶葉具有更加濃郁的玫瑰香氣和花果香味。綜合分析，在海拔150～700 m，隨著海拔的升高，維生素C和總氨基酸含量顯著升高，而茶多酚則隨著海拔升高呈下降趨勢。就香氣物質(zhì)而言，低海拔區(qū)域的茶葉具有更豐富更濃郁的茶香，而高海拔的茶葉香氣更溫和。從氧化穩(wěn)定性來看海拔300～500 m的茶葉抗氧化性能更強。