周晶 董笑克 馬青科 金香蘭 張志辰

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)患者標(biāo)志性病理改變?yōu)樯窠?jīng)斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)的產(chǎn)生，主要由β淀粉樣肽(beta-amyloid，Aβ)沉積和磷酸化的微管蛋白Tau(p-Tau)組成，這些病理改變周圍往往存在過表達(dá)的炎性細(xì)胞因子，抗炎治療可延遲AD的進(jìn)展，因此，認(rèn)為AD病理損傷主要與腦內(nèi)炎性反應(yīng)有關(guān)。黃連素是中藥黃連的主要有效成分之一，具有顯著的抗炎作用，團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn)150 mg/kg黃連素能顯著降低AD模型大鼠p-Tau表達(dá)，并改善大鼠認(rèn)知及記憶功能[1]，其作用機(jī)制是否與改善外周輔助性T細(xì)胞(T helper cell，Th)細(xì)胞比例，進(jìn)而減輕腦組織炎性水平相關(guān)，目前尚無報道。本研究旨在探究黃連素對AD模型大鼠外周血Th17及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T-cell，Treg)細(xì)胞比例的調(diào)節(jié)作用，及其對大鼠腦海馬組織炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠36只，6周齡，體重220±20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號：SYXK(京)：2019-0013。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動物中心，飼養(yǎng)級別為SPF級，5只/籠，保證正常光照節(jié)律、溫度適度、環(huán)境安靜，正常大鼠生長繁殖飼料飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 藥物及試劑

鹽酸小檗堿(成都錦華藥業(yè)有限公司，批號：180613)；Aβ25-35(美國Sigma公司，批號：053M4804V)，注射前用生理鹽水將Aβ25-35配制為10 μg/μL的溶液，在37℃孵育1周。大鼠抗CD3 APC(Ebioscience，貨號：17-0030-82)、CD4 FITC(Ebioscience，貨號：11-0040-82)、CD8 PerCP(Ebioscience，貨號：46-0084-82)、CD25 APC(Ebioscience，貨號：17-0390-82)、FoxP3 PE(Ebioscience，貨號：12-4774-42)、IL-17A PE(Ebioscience，貨號：12-7177-81)。

1.3 主要試驗儀器

流式細(xì)胞檢測儀(BD公司，型號：LSRⅡ)；大鼠數(shù)顯腦立體定位儀(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司，型號：ZS-B/S)；微量注射針(Trajan Scientific and Medical，規(guī)格：10 μL)；實驗動物飲水機(jī)(北京木牛流馬凈化工程技術(shù)有限公司，型號：MN-LM500J)；酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio-Tek，型號：Synergy H1)。

1.4 造模與給藥方法

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組，黃連素組，每組12只。假手術(shù)組大鼠注射生理鹽水，其余大鼠腹腔注射射D-半乳糖，100 mg/kg，每日1次，共注射6周。注射第3周時，1 %戊巴比妥鈉腹腔注射40 mg/kg麻醉大鼠。在大鼠腦立體定位儀下，自顱頂前囟向后4.4 mm、旁開 2.2 mm，硬腦膜下3.0 mm，微量注射泵緩慢注射 Aβ25-3510 μg于一側(cè)海馬，留針5分鐘，同樣方法將等劑量Aβ25-35注入對側(cè)海馬[2]。假手術(shù)組大鼠同方法注射等量生理鹽水。注射后大鼠傷口縫合，術(shù)區(qū)消毒。術(shù)后每天碘伏消毒傷口，連續(xù)3天。術(shù)中假手術(shù)組、模型組各死亡1只，死亡原因為麻醉因素。術(shù)后模型組、黃連素組各死亡1只，死亡原因為手術(shù)損傷。造模7周后進(jìn)行水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力測試，以第5天假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期均值為參考值，若各造模大鼠平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠平均逃避潛伏期的比值>20%則表示造模成功[3]。模型組及黃連素組各剔除未成模大鼠2只。注射第3周開始，黃連素組大鼠給予黃連素150 mg/kg灌胃，其余大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)干預(yù)4周。具體流程見圖1。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測方法

1.5.1 流式細(xì)胞計數(shù)檢測外周血Th17、Treg細(xì)胞比例 末次給藥結(jié)束后，大鼠禁食不禁水10小時以上，戊巴比妥鈉溶液40 mg/kg腹腔注射麻醉，打開腹腔，留取新鮮抗凝血液樣本，裂解紅細(xì)胞，快速提取分離T淋巴細(xì)胞，CD3+、CD8-、IL-17A+標(biāo)記Th17細(xì)胞，CD4+、CD25+、FoxP3+標(biāo)記Treg細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測各抗原的表達(dá)情況，檢測Th細(xì)胞亞群比例。

圖1 動物實驗操作部分流程圖

1.5.2 實時熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)檢測海馬組織炎性細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平 快速摘取大鼠新鮮海馬組織置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每組隨機(jī)選擇6例海馬組織，采用RT-PCR法檢測海馬組織白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-17、IL-22、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平，運(yùn)用 2-△△CT相對定量法比較各組目標(biāo)mRNA表達(dá)差異。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠外周血Th17、Treg細(xì)胞比例

用CD3-SSC設(shè)門，分析CD8-、IL-17A+細(xì)胞群比例，計算Th17細(xì)胞在總淋巴細(xì)胞中所占的比例，用CD4-SSC設(shè)門，分析CD25+、FoxP3+細(xì)胞比例。與假手術(shù)組相比，模型組Th17、Treg細(xì)胞比例升高(P<0.05)，與模型組相比，黃連素組Th17、Treg細(xì)胞比例一定程度下降，其中Th17降低有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例

2.2 各組大鼠海馬組織炎性細(xì)胞因子含量檢測

與假手術(shù)組相比，模型組海馬組織IL-1β、IL-6、IL-17、IL-22、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高(P<0.01)，TGF-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，黃連素組IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平均降低(P<0.05)，TGF-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高(P<0.05)。見表3。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥是阿爾茲海默癥的重要致病因素。促炎細(xì)胞因子的高表達(dá)也是AD的主要特征之一[4]，大量研究已證實炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α與AD病理損傷相關(guān)[5]。IL-1β是響應(yīng)組織損傷首批分泌細(xì)胞因子之一，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化和凋亡，在淀粉樣斑塊位點附近高表達(dá)[6]。 IL-1β驅(qū)動β-淀粉樣前體蛋白的合成，導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白斑塊的產(chǎn)生，并沉積在阿爾茨海默氏病患者的腦組織[7]。IL-1β也參與Tau蛋白磷酸化[8]。IL-6與AD的發(fā)病同樣密切相關(guān)，在AD患者血清、腦脊液、皮質(zhì)均可檢測到IL-6升高，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于Aβ之后也可檢測到IL-6水平升高。TNF-α參與誘導(dǎo)急性期炎癥細(xì)胞因子，在AD血清，腦脊液和皮質(zhì)中升高，過表達(dá)TNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出腦神經(jīng)嚴(yán)重的炎癥、神經(jīng)退行性病變，甚至死亡[9]。近些年科學(xué)家逐漸發(fā)現(xiàn)，AD患者外周血同樣存在促炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等高表達(dá)[10]，同時AD 患者Th細(xì)胞可能參與腦組織炎性反應(yīng)，Th17在AD患者外周血中比例顯著高于對照組，同時在腦組織中也發(fā)現(xiàn)了T淋巴細(xì)胞，認(rèn)為外周Th細(xì)胞可能通過受損的血腦屏障遷移進(jìn)入腦組織加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)[11-13]。Th17細(xì)胞可通過Fas/FasL凋亡途徑直接作用于神經(jīng)元。在AD模型大鼠海馬組織中，IL-17水平也顯著升高。Treg細(xì)胞是一類調(diào)節(jié)機(jī)體免疫耐受的T淋巴細(xì)胞亞群，在AD患者外周血中比例降低[14]，在AD模型大鼠的皮層和海馬中被抑制。研究表明，Treg細(xì)胞耗竭會加重AD模型大鼠認(rèn)知障礙，而全身性Treg給藥可改善疾病進(jìn)展。TGF-β是Treg細(xì)胞合成的主要細(xì)胞因子，TGF-β表達(dá)也顯著下降[15]。以上研究均提示了AD不僅與腦內(nèi)炎性反應(yīng)相關(guān)，與外周免疫功能同樣具有重要的關(guān)系。

圖2 大鼠外周血Th17、Treg細(xì)胞流式細(xì)胞檢測結(jié)果

表3 各組大鼠海馬組織炎性細(xì)胞因子含量比較

阿爾茲海默癥屬于中醫(yī)“癡呆”“呆癥”“郁證”等范疇，其主要病機(jī)為“髓海不足，神機(jī)失用”。黃連素是中藥黃連提取物，黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。黃連素是黃連的生物堿成分，是黃連發(fā)揮抗菌作用的主要物質(zhì)成分，被廣泛用來治療腸道感染性腹瀉。隨著研究的深入，黃連素逐漸被證實具有降糖、降壓、降脂、抗腫瘤、抗AD等作用，其作用機(jī)制與改善炎癥，減少組織炎性損傷密切相關(guān)[16]。

團(tuán)隊在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黃連素對AD大鼠具有改善認(rèn)知障礙的作用，并能顯著下調(diào)p-Tau蛋白表達(dá)。結(jié)合黃連素的藥理作用，及國內(nèi)外AD發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展，團(tuán)隊推測其治療AD的機(jī)制可能與改善腦組織炎性狀態(tài)密切相關(guān)，而黃連素并不能吸收入腦直接調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥狀態(tài)，團(tuán)隊推測黃連素極有可能改善外周Th細(xì)胞比例。因此本研究中，課題組結(jié)合流式細(xì)胞檢測技術(shù)，檢測外周Th17、Treg細(xì)胞比例，并選擇AD腦組織內(nèi)具有代表性的促炎性細(xì)胞因子，以期發(fā)現(xiàn)外周及中樞炎癥在黃連治療AD中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，AD模型大鼠外周Th17細(xì)胞比例顯著升高，Treg細(xì)胞比例顯著下降，存在免疫失衡，給予黃連素后能一定程度糾正Th17/Treg免疫失衡，特別是能顯著降低Th17細(xì)胞比例。與此一致的是，大鼠海馬組織促炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，TGF-β轉(zhuǎn)錄上調(diào)，提示了黃連素可以調(diào)節(jié)外周Th17、Treg細(xì)胞免疫平衡，降低腦組織炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17基因轉(zhuǎn)錄，增加TGF-β基因轉(zhuǎn)錄，從而起到改善AD的作用。然而，黃連素作為一種口服吸收度差的藥物，是如何起到調(diào)節(jié)外周和中樞炎癥的，仍需進(jìn)一步探索研究。團(tuán)隊推測黃連素可能通過改變腸道菌群，介導(dǎo)腸道相關(guān)淋巴組織影響外周淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，外周T淋巴細(xì)胞遷移進(jìn)入腦組織，影響中樞神經(jīng)組織細(xì)胞因子表達(dá)，最終起到減少炎癥介質(zhì)，改善AD腦損傷的作用，后續(xù)將展開一系列相關(guān)研究以進(jìn)一步闡釋黃連素治療AD的機(jī)制。