宋興輝，李艷偉，王佳佳，邢月婷，黃瑩瑩，郭春

（浙江大學(xué)，浙江杭州 310058）

用于細(xì)胞分離、純化的技術(shù)包括流式細(xì)胞分選技術(shù)、磁珠分選、重力沉降、密度梯度離心等，其中流式細(xì)胞分選技術(shù)具有不可替代性，因為其具有以下9個特點：（1）可以根據(jù)多個細(xì)胞參數(shù)（多種顏色的熒光標(biāo)記）來分選細(xì)胞群；（2）可以根據(jù)表面蛋白的密度差異（即同一信號的強(qiáng)弱差異）來分類分離細(xì)胞；（3）可以分離低密度表面抗原（即微弱信號）的細(xì)胞；（4）可以得到95%～100%極高純度的目標(biāo)細(xì)胞群（5）可以根據(jù)細(xì)胞功能活動及狀態(tài)特征來分選細(xì)胞，如非抗體標(biāo)記的胞吞、調(diào)亡等；（6）可以根據(jù)細(xì)胞內(nèi)的某些標(biāo)志，如DNA含量、熒光蛋白、胞內(nèi)抗原等分離細(xì)胞；（7）可以分選含量極低的稀有細(xì)胞（如0.001%或更低）；（8）可以分選感興趣的未知特征的細(xì)胞亞群；（9）可以進(jìn)行多孔板分選，如單克隆分選，在96、384、1536孔板每個孔中精確地分入1個細(xì)胞。

隨著科學(xué)研究的進(jìn)一步深入，精準(zhǔn)到單個細(xì)胞的研究日益增加，分離得到目標(biāo)單細(xì)胞成為這一研究中不可或缺的部分，而流式細(xì)胞分選則是其中的一項關(guān)鍵技術(shù)。本研究基于分選極低含量的稀有細(xì)胞和進(jìn)行多孔板分選的實驗?zāi)康暮蛯嶒炐枨?，對分選分案進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 儀器

moflo AstriosEQ超高速分選儀，，美國貝克曼庫爾特有限公司。分選選用100 nm噴嘴，鞘液壓力30 psi（約207 kPa），與樣品壓力的差為0.3 psi（約2 kPa），分選模式選擇單細(xì)胞（single）模式，液滴信封選擇0.5。首先利用校正微球調(diào)節(jié)儀器光路并執(zhí)行光路質(zhì)量檢測（QC），QC通過后，調(diào)節(jié)液路找到最佳液滴延遲值，在不對目標(biāo)細(xì)胞加電的模式（SD）下通過調(diào)節(jié)cyclone校準(zhǔn)液滴滴落在孔板每個孔上的位置，以備下面的分選實驗。

1.2 實驗方案

1.2.1 細(xì)胞準(zhǔn)備

為了滿足稀有細(xì)胞的要求，染色細(xì)胞和未染色細(xì)胞按1∶100的比例，即1%的陽性比例。細(xì)胞采用jurkat細(xì)胞，染色方法采用CFSE活細(xì)胞染料，按照1∶1 000染色5 min后，離心去除染料，PBS重懸后計數(shù)，與未染色細(xì)胞按照1∶100混合后得到1%陽性率的細(xì)胞懸液，待分選。

1.2.2 分選方案

（1）如圖1a所示，畫線性點圖，圈定細(xì)胞群，確定細(xì)胞群體位置；（2）如圖1b～1d所示，畫線性圖，以對角線畫門，去除細(xì)胞懸液中的粘連細(xì)胞；（3）如圖1e所示，畫對數(shù)點圖，圈定陽性細(xì)胞群。設(shè)置分選的門邏輯關(guān)系為細(xì)胞群&三次去粘連&陽性細(xì)胞群。找到目標(biāo)細(xì)胞群后，先運行1 min左右讓液流穩(wěn)定住，然后進(jìn)行96孔板分選，每孔設(shè)定1個細(xì)胞。96孔板中預(yù)先在每一個孔中加200 μL細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為1640培養(yǎng)基，10%血清和1%雙抗，共分選3塊96孔板。將分選后的96孔板放置于含5%二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，7 d后，置于顯微鏡下觀察，確定生成的單細(xì)胞克隆數(shù)，計算分選效率。

圖1 分選方案

2 結(jié)果與分析

通過流式分析的方法找到細(xì)胞群如圖2a所示，分析出陽性細(xì)胞，并分選至96孔板的每個孔中。7 d以后顯微鏡下觀察，找到如圖2b中的細(xì)胞克隆計數(shù)并統(tǒng)計。3塊孔板形成的單克隆數(shù)分別為88、82和79個，分選并能夠形成單細(xì)胞克隆的平均得率為86.5%。

圖2 細(xì)胞懸液中的活細(xì)胞群體及培養(yǎng)7 d后形成的單克隆

較多文獻(xiàn)中報道了[1-2]驗證單細(xì)胞分選得率的方案，但均局限于分選前期，即僅判定是否分至細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中，而此次實驗延伸至分選末期，不僅將單個細(xì)胞分選至單個孔中，還可以形成單克隆，采用的單細(xì)胞分選優(yōu)化方案利用單克隆的形成率更加準(zhǔn)確地說明了單細(xì)胞分選的效率。單細(xì)胞分選實驗中影響后期單細(xì)胞成活率或單克隆形成率的主要因素可歸納為以下4點。

（1）儀器光路和液路的精確性，尤其是液滴延遲的準(zhǔn)確性。光路的校正主要依靠QC校正微球，通過調(diào)節(jié)光路，使QC驗證通過，即可使儀器光路處于最佳工作狀態(tài)，而液路的調(diào)節(jié)即液滴延遲的調(diào)節(jié)，則更多地依靠儀器操作人員的經(jīng)驗。

（2）液滴降落的位置準(zhǔn)確。流式細(xì)胞分選的原理是通過對目標(biāo)細(xì)胞加電，然后在電極板的作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn)，降落至收集容器中。由于液滴有一定的偏轉(zhuǎn)角度，所以這給孔板分選時校正液滴降落位置帶來很多困難，有些研究者通過增加液滴數(shù)目，預(yù)分選后確定液滴降落位置，然后再進(jìn)行分選實驗。本實驗采用的是不對目標(biāo)細(xì)胞加電而是對中心液流加電偏轉(zhuǎn)的模式。在這個模式中，目標(biāo)細(xì)胞的降落方式為垂直降落，沒有偏轉(zhuǎn)角度，所以可以較為容易地準(zhǔn)確定位液滴降落位置。

（3）細(xì)胞活性。分選后的細(xì)胞活性對很多分選下游實驗影響很大，尤其是單細(xì)胞分選實驗。分選后的細(xì)胞活性很大程度上取決于分選前細(xì)胞活性，所以對分選后細(xì)胞活性要求高的實驗，必須確保分選前細(xì)胞的活性。

（4）溫度，包括待分選細(xì)胞懸液的存儲溫度和分選時溫度。細(xì)胞一旦離開最佳生長環(huán)境，低溫（4 ℃）是保持細(xì)胞最佳狀態(tài)的重要條件。所以在進(jìn)行分選實驗時，必須將細(xì)胞始終保持在低溫狀態(tài)下，才能使細(xì)胞有較高的活性，保證后續(xù)的存活率和單克隆形成率。

3 結(jié)論

本文通過對儀器光路和液路進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)節(jié),準(zhǔn)確確定液滴降落的位置,確保分選前細(xì)胞的活性,獲得單細(xì)胞分選的優(yōu)化方案,在此方案下單細(xì)胞克隆形成率達(dá)86.5%。