潘均悅

（山西省地質(zhì)礦產(chǎn)研究院，山西太原 030001）

糞大腸菌群是大腸菌群的一種，具體可以分為4類(lèi)，分別是腸桿菌屬、大腸埃希氏菌屬、枸櫞酸菌屬和克雷伯菌屬。糞大腸菌群屬于革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，是好氧、兼性厭氧菌，能夠發(fā)酵，分解乳糖產(chǎn)生酸和二氧化碳等氣體[1]。除了在人體中可以檢測(cè)到，糞大腸菌還可在排泄物中檢測(cè)出來(lái)。但有研究者從各地的水體中也檢測(cè)出來(lái)有此菌群，說(shuō)明即使在不是糞便污染的情況下，也有可能在水體中檢測(cè)到該菌群。如果水流上游甚至下游被糞便污染，水流動(dòng)中可能將整個(gè)水體污染，從而引發(fā)腸道病原菌感染及相關(guān)疾病。而糞大腸菌群檢測(cè)就是反應(yīng)糞便對(duì)水體污染情況的檢測(cè)手段。因此，通過(guò)糞大腸菌群檢測(cè)，對(duì)監(jiān)測(cè)水源處糞大腸菌群的污染狀況，從而進(jìn)行有效、及時(shí)、可靠的預(yù)測(cè)以及對(duì)流行疾病及時(shí)的控制與傳播有著重要意義。

1 糞大腸菌群檢測(cè)方法

1.1 發(fā)酵法

1.1.1 原理

大腸菌群可分解乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使多管發(fā)酵過(guò)程中乳糖蛋白胨培養(yǎng)基逐漸變?yōu)辄S色，且有氣泡產(chǎn)生。

1.1.2 檢測(cè)步驟

糞大腸菌群可以通過(guò)乳糖蛋白胨多管發(fā)酵，具體實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)流程有如下5個(gè)步驟[2]。

（1）無(wú)菌實(shí)驗(yàn)，即經(jīng)過(guò)滅菌消毒等過(guò)程，保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境無(wú)菌；對(duì)照試驗(yàn)，即保證其他無(wú)關(guān)因素相同，與實(shí)驗(yàn)組形成對(duì)照。

（2）提前準(zhǔn)備水樣本，設(shè)置5組實(shí)驗(yàn)組，按照水樣的污染程度確定接種量，一般選取10.00 mL、1.00 mL、0.10 mL、0.01 mL等。

（3）制備3倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液或一般濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，若接種體積為10 mL，則使用3倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液；若接種體積為1 mL或小于1 mL，則使用一般濃度培養(yǎng)液。

（4）進(jìn)行初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，首先將檢測(cè)水樣進(jìn)行攪拌混合均勻，然后接種到裝有培養(yǎng)液的試管中，同時(shí)要保證儲(chǔ)存試管和5份培養(yǎng)液都是已滅菌無(wú)雜質(zhì)的狀態(tài)。在（37.5±0.5）℃條件下培養(yǎng)（24±2）h。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則說(shuō)明該試管為陽(yáng)性。

（5）進(jìn)行復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，輕微振蕩初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中呈陽(yáng)性的試管，在溫度為（44.5±0.5）℃的恒溫條件下放置培養(yǎng)（24±2）h。在發(fā)酵過(guò)程中，由于水樣中菌群種類(lèi)可能不只是目標(biāo)菌群，培養(yǎng)基中可能會(huì)生長(zhǎng)出其他種類(lèi)菌落。為了保證目標(biāo)菌群的純度，需要將其他菌落提取出來(lái)，置于EC肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，要求在溫度（44.5±0.5）℃的條件下培養(yǎng)（24±2）h并進(jìn)行觀(guān)測(cè)。觀(guān)測(cè)過(guò)程中，如果有陽(yáng)性產(chǎn)氣現(xiàn)象，則證明有大腸菌群生長(zhǎng)。發(fā)酵過(guò)程中，利用最大可能數(shù)MPN值和MPN指數(shù)的關(guān)系進(jìn)行計(jì)算。

乳糖蛋白胨多管發(fā)酵法是至今為止我國(guó)最常使用的糞大腸菌群檢測(cè)方法，也在各個(gè)國(guó)家中廣泛使用。各界研究人員對(duì)此檢測(cè)方法的認(rèn)識(shí)達(dá)成了一致，因此乳糖蛋白胨多管發(fā)酵法屬于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法。這種檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)：操作起來(lái)所需成本如財(cái)力物力人力較低，對(duì)操控的技術(shù)要求不高，在技術(shù)方面的花費(fèi)相對(duì)較少，同時(shí)還能夠得到相對(duì)準(zhǔn)確的結(jié)果。缺點(diǎn)：在實(shí)際操作方面步驟繁瑣條件過(guò)多，在實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論時(shí)不能馬上使用，需要開(kāi)展驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果是否準(zhǔn)確，但檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠程度很容易受到外部環(huán)境的影響，如實(shí)驗(yàn)人員數(shù)量、樣品量、實(shí)驗(yàn)容器的無(wú)菌狀況等；同時(shí)，檢測(cè)所需時(shí)間也很長(zhǎng)。

多管發(fā)酵法的實(shí)驗(yàn)開(kāi)展需要龐大的實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)才能完成，但一般基層機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰o(wú)法滿(mǎn)足。在研究人員對(duì)實(shí)驗(yàn)方法的不斷改進(jìn)下，多管發(fā)酵法發(fā)展為五管法、十管法和十五管法等。以十五管法為例，其具體步驟如下：（1）樣品采集，通過(guò)肉眼觀(guān)察清澈水體，一般為自然流水、城市流動(dòng)河水和排放污水；（2）樣品稀釋和接種，當(dāng)接種量小于1 mL時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行10倍或100倍的稀釋。無(wú)菌條件下，在5支裝有3倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中各接種樣品10 mL，在10支裝有單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，5支接種樣品1 mL，5支接種樣品0.1 mL；（3）將接種后的試管在（37±0.5）℃下培養(yǎng)（24±2）h進(jìn)行初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，選擇產(chǎn)酸產(chǎn)氣的陽(yáng)性試管進(jìn)行復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，在（44.5±0.5）℃下培養(yǎng)（24±2）h后進(jìn)行對(duì)照觀(guān)察及計(jì)算。

1.2 濾膜法

1.2.1 原理

提前對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行滅菌處理，在過(guò)濾器中放入微孔濾膜，將水樣緩慢倒入過(guò)濾器中，應(yīng)用抽濾法進(jìn)行過(guò)濾。抽濾過(guò)后，菌種將會(huì)過(guò)濾吸附在濾膜表面。制備糞大腸桿菌培養(yǎng)基（MFC選擇性培養(yǎng)基），并將濾膜貼合在培養(yǎng)基表面進(jìn)行接種，保持環(huán)境溫度為（44.5±0.5）℃恒溫，進(jìn)行培養(yǎng)觀(guān)察。待培養(yǎng)基上長(zhǎng)出糞大腸菌群后，觀(guān)察是否符合菌群特征，然后進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算平均每升水樣中糞大腸菌群的數(shù)量。

1.2.2 檢測(cè)方法

（1）過(guò)濾檢測(cè)水樣，使用無(wú)雜質(zhì)無(wú)菌的工具鑷起滅菌濾膜的邊緣，將細(xì)膩的一面放在下面，在過(guò)濾器中貼合濾床，并進(jìn)行滅菌，加入10 mL無(wú)菌清澈水樣，再用已滅菌無(wú)雜質(zhì)的吸管提取混勻均勻的待檢測(cè)水樣，打開(kāi)過(guò)濾器閥門(mén)，在負(fù)壓50 kPa下進(jìn)行抽濾。

（2）培養(yǎng)細(xì)菌，水樣濾完后，繼續(xù)抽出實(shí)驗(yàn)儀器中的氣體5 s，并關(guān)閉過(guò)濾器的閥門(mén)。對(duì)操作工具進(jìn)行滅菌，將過(guò)濾器下置，帶菌濾膜放置到MFC培養(yǎng)基表面，進(jìn)行接種。注意在接種時(shí)要將濾膜吸附菌種的一面朝上，且濾膜應(yīng)當(dāng)緊貼培養(yǎng)基，以避免菌種無(wú)法正常生長(zhǎng)。培養(yǎng)操作完成后，將培養(yǎng)皿密封倒置于培養(yǎng)箱中，保持（44.5±0.5）℃恒溫環(huán)境，培養(yǎng)（24±2）h。

（3）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并報(bào)告結(jié)果，對(duì)菌落數(shù)量進(jìn)行觀(guān)察計(jì)數(shù)。因?yàn)榧S大腸桿菌菌落為藍(lán)色或藍(lán)綠色，很容易和其他菌落顏色區(qū)別開(kāi)來(lái)；且在培養(yǎng)環(huán)境溫度下，其他菌落或與培養(yǎng)基試劑反應(yīng)，或不易生長(zhǎng)，所以MFC培養(yǎng)基上大部分是糞大腸菌群菌落。如有疑似菌種，則可將疑似菌落滴入EC培養(yǎng)液，保持（44.5±0.5）℃恒溫，并培養(yǎng)觀(guān)測(cè)（24±2）h。統(tǒng)計(jì)顏色為藍(lán)色或藍(lán)綠色的糞大腸菌群菌落，根據(jù)體積和濃度關(guān)系，通過(guò)公式1計(jì)算得出每升水樣中糞大腸菌群菌落的數(shù)量。

其中，菌群菌落數(shù)目單位為個(gè)/L，過(guò)濾水樣量單位為mL。

1.3 紙片快速檢測(cè)法

1.3.1 原理

實(shí)驗(yàn)所采用的濾紙吸收選擇性的培養(yǎng)基，需要將濾紙與培養(yǎng)基貼合，在特定溫度下培養(yǎng)24 h。細(xì)菌繁殖會(huì)產(chǎn)生酸，可使溴甲酚紫指示劑變?yōu)辄S色，且脫氫酶會(huì)將底物還原成三苯甲臜，顯紅色，故觀(guān)察到的現(xiàn)象為黃色背景下出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。通過(guò)以上現(xiàn)象便可判斷樣品中大腸菌群存在與否及濃度。

1.3.2 檢測(cè)方法

紙片快速檢測(cè)法和發(fā)酵法的實(shí)驗(yàn)相似：（1）取10 mL水樣接種，需要選取接種所用的5張紙片，規(guī)格為15 cm×l0 cm；（2）取1 mL水樣接種，需要選取接種所用的10張紙片，規(guī)格為5 cm×6 cm，用5張紙片進(jìn)行常規(guī)接種，另外5張紙片接種檢測(cè)水樣10倍稀釋液各1 mL；（3）在恒溫（44.5±0.5）℃的環(huán)境下放置18～24 h，觀(guān)察并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，統(tǒng)計(jì)紙片陽(yáng)性情況，并與MPN值表進(jìn)行比較。其中，陰性陽(yáng)性判斷準(zhǔn)則如下：菌落顏色為紫紅色，外部伴有黃色圓圈，則為陽(yáng)性；菌落形狀為片狀，顏色為紅色，外部伴有黃色圓圈，則為陰性。

1.4 酶底物法

1.4.1 原理

大腸菌群菌落能夠產(chǎn)生半乳糖苷酶，從而分解乳糖，使培養(yǎng)基有菌部分變?yōu)辄S色；而大腸埃希氏菌葡萄糖醛酸酶，可以分解葡萄糖，產(chǎn)生的物質(zhì)可在366 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外檢測(cè)，觀(guān)測(cè)顯示熒光現(xiàn)象，從而可以定量統(tǒng)計(jì)出糞大腸菌群數(shù)[3-4]。

1.4.2 檢測(cè)方法

（1）酶底物檢測(cè)法選用51孔的定量盤(pán)法，定量盤(pán)法是一種以MPN為基礎(chǔ)的方法。（2）檢測(cè)水樣容量為100 mL，先使用100 mL無(wú)菌無(wú)雜質(zhì)的量瓶量取出100 mL測(cè)試水樣，并在水樣中加入一定量的MMO－MUG粉末，攪拌均勻。（3）準(zhǔn)備容量為5 L的無(wú)菌定量盤(pán)，將制備好的水樣溶液倒入其中。（4）用工具消除定量盤(pán)內(nèi)的氣泡，并進(jìn)行密封操作。（5）在培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)置（44.5±0.5）℃的恒溫環(huán)境，并進(jìn)行觀(guān)測(cè)，培養(yǎng)（24±2）h，若檢測(cè)水樣變黃，則說(shuō)明大腸菌群菌落的存在。

2 不同檢測(cè)方法的檢測(cè)效果對(duì)比

如表1所示，為糞大腸菌群各檢測(cè)方法的比較。由表1可知，發(fā)酵法和濾膜法實(shí)驗(yàn)步驟多、干擾多、可行度不夠高，且實(shí)驗(yàn)周期比較長(zhǎng)，實(shí)際應(yīng)用不太方便。紙片快速檢測(cè)法與發(fā)酵法相比，只需要保持溫度（44.5±0.5）℃，時(shí)間在18～24 h就可得出結(jié)果，檢測(cè)較快捷，通常用在需要快速出結(jié)果的檢測(cè)任務(wù)中。酶底物法操作簡(jiǎn)單，用時(shí)短，只需要進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)就可滿(mǎn)足檢測(cè)要求，但花費(fèi)較高[5]。

表1 糞大腸菌群各檢測(cè)方法比較

3 結(jié)語(yǔ)

我國(guó)科學(xué)技術(shù)和生物化學(xué)檢測(cè)技術(shù)在不斷進(jìn)步，糞大腸菌群的檢測(cè)方式也更加多樣，用時(shí)更短，可信度和實(shí)驗(yàn)效率更高。目前比較通用的方法有發(fā)酵法、酶底物法、濾膜法等，各種檢測(cè)方法都有其存在合理性，通過(guò)今后不懈的努力，會(huì)研究出更多、更實(shí)用的檢測(cè)方法，如進(jìn)一步縮減檢測(cè)的花費(fèi)成本、縮減檢測(cè)等待的時(shí)間、加強(qiáng)檢驗(yàn)效率和結(jié)果可信度等，并賦予糞大腸菌群檢測(cè)更多的使用價(jià)值。