徐園，錢強，鮑世民，肖君華，李凱*

（1.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 2016202；2.中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，上海 200031）

近交系與封閉群大鼠作為重要的動物模型，在臨床前藥物實驗、毒理實驗等科研工作中起著愈來愈重要的作用[1]。但是大鼠經(jīng)過多年繁育，群間遺傳分化嚴重，使試驗數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性大大降低，急需對大鼠建立遺傳學(xué)標(biāo)準，通過遺傳監(jiān)測手段保持其遺傳穩(wěn)定性[2]。商海濤等[3]用6個微衛(wèi)星標(biāo)記分析北京和上海兩家單位的Wistar和SD大鼠，結(jié)果表明各群體的遺傳多樣性保持良好，但群間遺傳差距較大。

目前，國內(nèi)外對小鼠的遺傳質(zhì)量監(jiān)測的研究較多，而對大鼠的遺傳質(zhì)量監(jiān)測研究較少。實驗動物遺傳檢測方法主要是以近交系小鼠和大鼠為基礎(chǔ)建立起來的，常用的方法主要包括毛色基因檢測法、生化標(biāo)記基因檢測法、免疫標(biāo)記基因檢測法、下頜骨形態(tài)測量分析法以及分子標(biāo)記檢測法[4]。傳統(tǒng)方法的操作復(fù)雜，實驗周期長且耗費大量的人力物力，亟待找到一種簡便、快速且價格低廉的方法來滿足目前對實驗動物遺傳品質(zhì)越來越高的要求。

基于多重PCR的單核苷酸多態(tài)性（SNP）分型方案，是一種高通量與高特異性的SNP分型方案[5]。本研究在PCR-LDR（連接酶檢測反應(yīng)）技術(shù)的SNP分型方案用于小鼠遺傳鑒定的基礎(chǔ)上[6]，將同樣的方法運用于大鼠，篩選出大鼠染色體上均勻分布的90個SNP位點，并采用靶向建庫測序技術(shù)，以期實現(xiàn)大鼠遺傳質(zhì)量檢測的高通量SNP分型方案。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

選取來自上海斯萊克實驗動物有限公司（SYXK（滬）2007-0005）SHR、WKY、GK、F344共 4個近交系及SD封閉群大鼠，數(shù)量分別為9只、7只、4只、8只和7只，共35只。動物實驗遵守《中國實驗動物管理條例》。收集這些大鼠尾巴1 cm左右，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器和試劑

A-100 PCR儀，購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；Gene Amp PCR system 9600 PCR儀，購自美國Norwalk公司；JY600+電泳儀，購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；FR-200A全自動紫外與可見分析裝置、生物電泳圖像分析系統(tǒng)，均購自上海復(fù)日科技有限公司。

PCR引物（PAGE純化）由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；dNTP（promega）購自上海有漁生物工程有限公司；Taq酶體系和ddH2O為實驗室自制。

1.3 SNP位點選取

如圖1所示，挑選的SNP分布于所有的常染色體與X染色體上，每條染色體所含SNP最少為4個，最多為9個。Y染色體因為雄性大鼠獨有，且多樣性低，故未選擇。

1.4 DNA提取

DNA提取采用TianGEN（天根生化科技有限公司）組織基因組抽提試劑盒，操作步驟依說明書進行。吸取1 mL抽提好的DNA，在0.8%瓊脂糖凝膠電泳中檢測其濃度，然后將所有的DNA樣本標(biāo)化到濃度為30 ng/mL，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 所選取SNP位點在大鼠基因組上的分布

1.5 引物設(shè)計

引物用Primer3在線軟件（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）設(shè)計[21]，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物大小在200～250 bp，引物長度為20～30 bp，熔解溫度（Tm）為55～65 ℃，GC含量為20%～80%。為了區(qū)分不同的樣品，設(shè)計了96對含有索引序列和通用序列的條形碼引物。最后使用Illumina公司的P5與P7引物，統(tǒng)一建庫。大鼠位點使用特異性引物見表1。

1.6 靶向SNP建庫和測序

建庫策略：第一輪PCR反應(yīng)以大鼠基因組DNA為模板，在兩端加上特異引物和接頭序列進行擴增；第二輪PCR擴增使用第一輪擴增產(chǎn)物作為模板，使用與接頭匹配的通用引物，同時在引物兩端加上后續(xù)測序所需要的標(biāo)簽。PCR的測序策略如圖2所示。PCR反應(yīng)條件優(yōu)化為95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 2 min，72 ℃ 30 s，進行 5 個循環(huán)[7]。建庫產(chǎn)物送金唯智生物（蘇州金唯智生物科技有限公司，中國蘇州）進行高通量測序，使用機型為illumina X-10，上機前產(chǎn)物經(jīng)安捷倫2100質(zhì)控。

1.7 測序數(shù)據(jù)的分析和SNP的識別

所有的測序數(shù)據(jù)用FASTX-Toolkit[8]根據(jù)每一條序列的索引序列分配到不同的樣本中，再將索引序列和接頭序列用Cutadapt[9]軟件去除。所得到的干凈序列使用bwa[10]軟件和參考基因組比對得到sam格式的文件。所得的sam格式文件通過samtools[11]軟件得到mpileup文件，然后生成最終報告。對于SNP的檢出，過濾小于15×測序深度位點，雜合子判定標(biāo)準為等位基因的序列讀長比例在20%～80%。

表1 大鼠位點使用特異性引物

圖2 兩步法Hi-SNP建庫流程

圖3 測序數(shù)據(jù)分析流程

2 結(jié)果與討論

2.1 擴增子均一性

樣本均一性對于靶向重測序是非常重要的性能指標(biāo)，這將決定在平均測序深度下的SNP測定率。在這批樣本中總擴增子數(shù)量4 205個，根據(jù)SNP鑒定時，有效深度大于等于15×，其中有3 607個擴增子獲得有效覆蓋度，即有效擴增子的數(shù)量為85.8%，深度的平均值為446×，深度的中值為229×。本批樣本85.8%的擴增子最后獲得SNP數(shù)據(jù)（圖4）。

隨后，每個擴增子深度對平均深度進行了歸一化，如此則可直接觀察到平均測序深度對每個擴增子的影響，即可評價總體均一度。從圖5可以看出，大部分的數(shù)據(jù)分布于平均深度的10倍范圍以內(nèi)，有較高的總體均一度，從而使總體測序量得以降低。

圖4 大鼠擴增子測序深度

圖5 擴增子相對深度累計曲線

2.2 Hi-SNP特異性

從圖6可以明顯看出，測序深度的增加，使得雜合子二等位基因比例向1∶1靠攏，而純合子的非特異等位基因數(shù)目比例則下降，即有效測序深度的增加有利于提高SNP的準確性。

圖6 SNP位點等位基因比例

如圖7所示，從各品系大鼠SNP等位基因所在reads比例來看，該批次F344大鼠、GK大鼠、SHR大鼠和WKY大鼠絕大部分樣本為純合子，為近交系大鼠，符合遺傳質(zhì)量檢測的要求。雜合子絕大部分來源于SD大鼠，為封閉群大鼠。

圖7 各品系大鼠SNP位點等位基因reads比例

2.3 SNP位點在品系間的差異分析

運用mega軟件，采用極大似然法查看各品系大鼠之間的遺傳距離。各品系大鼠，除SD大鼠，基本上聚集在一起。同時可以發(fā)現(xiàn)SHR大鼠和WKY大鼠與其他品系大鼠有較大的差異。

圖8 各大鼠運用極大似然法構(gòu)建的聚類圖

多重PCR靶向二代測序SNP分型方法相比于形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)以及生物化學(xué)方法有著明顯優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在通量大、建庫方便、測序深度高、性價比高、特異性強、分辨率高和價格低廉等方面。

高通量二代測序技術(shù)的發(fā)展，也使大規(guī)模樣本的基因組目標(biāo)區(qū)域及候選基因區(qū)域的測序成為可能。由此而建立的基于高通量測序的SNP分型技術(shù)，即是利用多重PCR，獲得含有目的的SNP位點基因組片段，定量混合后測序。相較于傳統(tǒng)的PCR-RFLP（限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)）、PCR-SSCP（聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析），直接測序和基因芯片等SNP分型方法，具有以下優(yōu)勢：（1）針對性強，目標(biāo)區(qū)域測序更有針對性，可以依賴大量的前期研究成果，獲得候選染色體區(qū)域片段；（2）信息量大，目標(biāo)區(qū)域測序可以完整覆蓋整個基因區(qū)域，不僅可以獲得高頻SNP的分型數(shù)據(jù)，還可以發(fā)現(xiàn)低頻的和個體特有的變異；（3）費用低，多重PCR是一種高效、高產(chǎn)率的目標(biāo)DNA富集技術(shù)，比起液相雜交，Long PCR擴增等富集技術(shù)，能提高富集效率，加速實驗進程，結(jié)合高通量測序，同時可對數(shù)百個樣本進行快速測序，大大降低了研究成本。

3 結(jié)論

鑒于國內(nèi)應(yīng)用SNP標(biāo)記分析通量相對較低，且尚未建立針對我國常用大鼠進行系統(tǒng)而有效遺傳檢測的高通量SNP位點組合（SNPpanel）、SNP遺傳檢測的方法及判定標(biāo)準上的現(xiàn)狀，本研究通過高通量多重PCR技術(shù)聯(lián)合二代測序，優(yōu)化出一套可用于大鼠品系遺傳質(zhì)量快速檢測的高通量SNP鑒定方法，并易于標(biāo)準化流程，有利于提高我國大鼠遺傳質(zhì)量控制的標(biāo)準。