王娟菲，李海源，秦 君，商文靜，胡小平

(農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

棉花黃萎病是典型的土傳性真菌病害，病原菌從棉花根部入侵，越過(guò)皮層到達(dá)維管束后，隨水分的輸送向上傳播[1]，繼而引起葉片的黃化萎蔫和脫落，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株死亡。1966年Schnathorst從抗病性顯著下降的抗黃萎病棉株中分離出兩株黃萎病致病菌系，按其對(duì)3個(gè)鑒別品種 ‘海島棉’‘岱字棉’和‘愛字棉’上的反應(yīng)型劃分為兩個(gè)類型：非落葉型SS-4菌系和落葉型T9菌系，T9菌系的毒力比SS-4的強(qiáng)10倍[2]。與非落葉型菌株相比，落葉型菌株具有引致棉花發(fā)病重、發(fā)病快、損失嚴(yán)重等特點(diǎn)[3-7]。

ABA(Absicisic acid)是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及非生物和生物脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵植物激素[8]。在植物響應(yīng)外界環(huán)境壓力、調(diào)節(jié)氣孔開放、調(diào)控葉片脫落、種子萌發(fā)與休眠等非生物脅迫中起重要的調(diào)節(jié)作用[9-12]。同時(shí)，ABA也在病原菌侵染和寄主免疫過(guò)程發(fā)揮作用，當(dāng)ABA含量增加兩倍，番茄灰霉病的發(fā)病率可降低50%[13]。在稻瘟菌與ABA互作中，ABA在免疫反應(yīng)中起負(fù)向調(diào)控作用，與SA信號(hào)通路相拮抗參與植物免疫過(guò)程[14]。研究表明，病原菌可以通過(guò)內(nèi)源產(chǎn)生低水平ABA參與調(diào)控植物的免疫反應(yīng)，如薔薇色尾孢霉菌Cercosporarosicola，菜豆尾孢霉菌Cercosporacruenta和灰葡萄孢霉菌Botrytiscinerea[15-16]。bcaba1是灰葡萄孢霉菌上第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的ABA合成相關(guān)基因[17]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)bcaba2、bcaba3和bcaba4基因也參與灰葡萄孢霉菌ABA的合成[18]。目前，多數(shù)研究主要集中在干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫下ABA的產(chǎn)生以及對(duì)植物生理生長(zhǎng)等的影響[12，19-22]。但尚未見到關(guān)于ABA與大麗輪枝菌落葉型菌株引起棉花落葉關(guān)系的研究報(bào)道。

本文通過(guò)NCBI比對(duì)灰葡萄孢霉菌ABA合成相關(guān)基因，得到落葉型大麗輪枝菌XJ592中ABA合成相關(guān)基因Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba2(2)和Vdaba4，對(duì)4個(gè)基因進(jìn)行克隆和敲除，比較分析其產(chǎn)孢量、菌落形態(tài)、壓力響應(yīng)、致病性、落葉情況等，了解這些基因?qū)Υ篼愝喼纳飳W(xué)特性及致病性的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

野生型大麗輪枝菌XJ592菌株(落葉型菌株)和根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105由西北農(nóng)林科技大學(xué)土傳病害實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自康為世紀(jì)公司。敲除質(zhì)粒pOSCAR和帶有潮霉素篩選標(biāo)記的質(zhì)粒pA-Hyg-OSCAR均由Fungal Genetics Stock Center(www.fgsc.net)提供。

1.2 ABA合成基因生物信息學(xué)分析

在NCBI(National Centre of BiotechnologyInformation)網(wǎng)站搜索灰葡萄孢霉菌ABA合成基因bcaba1、bcaba2、bcaba3和bcaba4的蛋白質(zhì)序列信息，使用Blastp程序進(jìn)行大麗輪枝菌中同源蛋白的搜索和比對(duì)分析。

1.3 敲除載體構(gòu)建及敲除突變體的獲得

參照Pazet的報(bào)道，設(shè)計(jì)同源臂擴(kuò)增引物用于擴(kuò)增目的基因Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba2(2)和Vdaba4的側(cè)翼序列，構(gòu)建基因敲除載體[23]。通過(guò)PCR和酶切驗(yàn)證后，將陽(yáng)性敲除載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。根據(jù)轉(zhuǎn)化子能擴(kuò)增出潮霉素抗性基因Hyg但不能擴(kuò)增出目的基因的原則，得到候選敲除轉(zhuǎn)化子。將具有潮霉素B(50 μg/mL)抗性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行單孢純化。采用PCR檢測(cè)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 產(chǎn)孢量測(cè)定

配制濃度為1×106個(gè)/mL的敲除突變體菌株孢子懸浮液。吸取100 μL孢子懸浮液，接種至裝有50 mL Czapek液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于25 ℃、120 r/min條件下黑暗搖培7 d后，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量孢子懸浮液濃度，以野生型XJ592菌株為對(duì)照，重復(fù)3次。

1.5 壓力敏感性測(cè)定

在PDA上培養(yǎng)7 d的野生型、敲除突變體菌落邊緣打直徑為5 mm的菌餅,分別接種到CM培養(yǎng)基、含有0.03% H2O2(氧化壓力)、0.01% SDS(細(xì)胞壁壓力)、1.2 mol/L山梨醇(滲透壓力)、0.7 mol/L NaCl(鹽脅迫)、0.2 g/L剛果紅(細(xì)胞壁脅迫)的CM平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)15 d后觀察菌落特征，用“十字”交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理接種3個(gè)培養(yǎng)皿，重復(fù)3次。

1.6 致病力測(cè)定

接種方法參照棉花孢子懸浮液浸根接種法[24]。待棉花幼苗長(zhǎng)到2片真葉平展時(shí)，將棉苗小心取出，用清水清洗干凈，浸在孢子濃度為106個(gè)/mL的懸浮液中30 min，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照。接種21 d后，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率，計(jì)算病情指數(shù)。接菌后30 d統(tǒng)計(jì)棉花的落葉數(shù)量和落葉率。病情指數(shù)=[∑(各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)病級(jí))/(調(diào)查總株數(shù)×4)]×100[25]。

1.7 數(shù)據(jù)分析的方法

產(chǎn)孢量采用SAS v8.01軟件的TTEST過(guò)程進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)(P=0.05)分析，野生型菌株和敲除突變體菌株的菌落直徑、壓力篩選及病情指數(shù)等的方差分析采用ANOVA過(guò)程進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABA合成基因的生物信息學(xué)分析

基于灰葡萄孢霉菌的ABA合成相關(guān)基因bcaba1(AJ609392)、bcaba2(AJ851088)、bcaba3(AM237449)和bcaba4(AM237450)[11]蛋白序列，與大麗輪枝菌基因組序列經(jīng)Blastp比對(duì)共得到4個(gè)同源基因，分別命名為Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba2(2)、Vdaba4(表1)。

表1 基因基本信息Table 1 Basic information of genes

2.2 敲除載體構(gòu)建及突變體篩選

用CTAB法提取大麗輪枝菌XJ592基因組DNA，使用Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba2(2)和Vdaba4基因的上下游引物分別擴(kuò)增其側(cè)翼序列，采用OSCAR一步法構(gòu)建基因敲除載體[15]，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用潮霉素抗性基因檢測(cè)引物Hyg-F和Hyg-R檢測(cè)陽(yáng)性菌落并送擎科生物公司測(cè)序，將測(cè)序正確的菌落接種于LB培養(yǎng)基搖培，提取質(zhì)粒。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)入野生型菌株XJ592中，經(jīng)過(guò)50 mg/L潮霉素抗性篩選，并使用潮霉素基因檢測(cè)引物、目的基因檢測(cè)引物對(duì)敲除轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證，共得到8個(gè)突變體菌株(圖1)。選取△Vdaba1-20、△Vdaba1-21、△Vdaba2(1)-48、△Vdaba2(1)-36、△Vdaba2(2)-20、△Vdaba2(2)-11、△Vdaba4-12、△Vdaba4-11等8個(gè)代表性突變體進(jìn)行下一步研究。

A：潮霉素引物PCR電泳圖。M：DL2000Maker；泳道1：pA-Hyg-OSCAR質(zhì)粒；泳道2：野生型XJ592；泳道3-10：敲除突變體 △Vdaba1-20、 △Vdaba1-21、 △Vdaba2(1)-48、 △Vdaba2(1)-36、 △Vdaba2(2)-20、 △Vdaba2(2)-11、 △Vdaba4-12、 △Vdaba4-11；泳道11：陰性對(duì)照。B、C、D、E：目的基因檢測(cè)結(jié)果電泳圖。M：DL2000Maker；B圖，泳道1-2：敲除突變體 △Vdaba1-20、 △Vdaba1-21；泳道3：野生型XJ592；C圖，泳道1-2：敲除突變體 △Vdaba2(1)-36、 △Vdaba2(1)-48；泳道3：野生型XJ592；D圖，泳道1-2：敲除突變體 △Vdaba2(2)-11、 △Vdaba2(2)-20；泳道3：野生型XJ592；E圖， 泳道1-2：敲除突變體 △Vdaba4-12、 △Vdaba4-11；泳道3：野生型XJ592。

2.3 產(chǎn)孢量測(cè)定

將野生型菌株和突變體菌株接種于液體查氏培養(yǎng)基中，120 r/min室溫?fù)u培，7d后測(cè)孢子濃度。結(jié)果表明，突變體△Vdaba2(1)-48、△Vdaba2(1)-36、△Vdaba2(2)-20、△Vdaba2(2)-11、△Vdaba4-12和△Vdaba4-11產(chǎn)孢量與野生型的無(wú)顯著性差異，而突變體△Vdaba1-20和△Vdaba1-21產(chǎn)孢量顯著少于野生型的(圖2)，說(shuō)明Vdaba1參與大麗輪枝菌孢子的形成，Vdaba2(1)、Vdaba2(2)和Vdaba4對(duì)大麗輪枝菌的產(chǎn)孢過(guò)程沒有顯著作用。

2.4 菌落形態(tài)觀察及壓力篩選

將野生型XJ592和4個(gè)基因共8個(gè)突變體接種于CM培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗培養(yǎng)15 d，運(yùn)用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體△Vdaba2(1)-48、△Vdaba2(1)-36、△Vdaba2(2)-20和△Vdaba2(2)-11菌落直徑顯著小于野生型的，突變體△Vdaba4-12、△Vdaba4-11、△Vdaba1-20和△Vdaba1-21菌落直徑與野生型無(wú)顯著差異。在含有20 μg/mL SDS培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)15 d后，突變體△Vdaba2(1)-48、△Vdaba2(1)-36、△Vdaba4-12、和△Vdaba4-11菌落直徑顯著高于野生型XJ592的(圖3)。在 0.03% H2O2壓力脅迫下，突變體△Vdaba4-12和△Vdaba4-11菌落直徑顯著受到抑制，△Vdaba1-20、△Vdaba1-21、△Vdaba2(1)-48和△Vdaba2(1)-36突變體菌落直徑顯著增大?？梢奦daba4基因的存在可以使大麗輪枝菌更能適應(yīng)氧化環(huán)境。在1.2 mol/L山梨醇?jí)毫ο?，所有突變體菌落直徑均顯著大于野生型的，說(shuō)明ABA合成相關(guān)基因可負(fù)向調(diào)節(jié)大麗輪枝菌對(duì)滲透壓的敏感性。在含有0.7 mol/L NaCl的培養(yǎng)基上，只有△Vdaba2(2)突變體與野生型直徑無(wú)顯著差異，其余突變體菌落直徑均顯著大于野生型的，說(shuō)明Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba4的存在使大麗輪枝菌對(duì)鹽脅迫更敏感。在0.2 g/L剛果紅壓力脅迫中，只有△Vdaba2(1)菌落直徑顯著減小。

“*”表示P=0.05下具有顯著性差異 “*”Significant difference at P=0.05

*表示經(jīng)單因素方差分析P=0.05水平具有顯著性 *Significant difference at P=0.05

2.5 致病力測(cè)定

野生型XJ592和基因突變體菌株接種‘冀棉11’，21 d后，接種野生型和突變體的棉花植株都表現(xiàn)出典型的黃萎病癥狀(圖4)。按照棉花黃萎病苗期病害調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，突變體△Vdaba1-20、△Vdaba1-21、△Vdaba4-12和△Vdaba4-11菌株接菌棉花植株的病情指數(shù)低于野生型菌株的，而突變體△Vdaba2(1)-48、△Vdaba2(1)-36、△Vdaba2(2)-20和△Vdaba2(2)-11的病情指數(shù)與野生型無(wú)顯著差異(圖5)。接種30 d后，所有突變體都可以引起整株棉花葉片全部脫落，與野生型XJ592菌株接菌植株無(wú)差異(數(shù)據(jù)略)。

圖4 野生型及突變體菌株接種棉花21 d后發(fā)病情況Fig.4 Disease symptoms of cotton at 21 days post inoculation of XJ592 and mutants

“*”表示經(jīng)單因素方差分析P=0.05具有顯著性差異 “*”Significant difference at P=0.05

3 討 論

通過(guò)對(duì)大麗輪枝菌侵染寄主引發(fā)寄主落葉或葉片萎蔫而不脫落的表型可將大麗輪枝菌分為落葉型和非落葉型[2]，落葉性狀是大麗輪枝菌種群演化的重要類型。在中國(guó)，隨著陸家云首次報(bào)道落葉型大麗輪枝菌之后，在全國(guó)主產(chǎn)棉區(qū)也陸續(xù)開展了落葉型大麗輪枝菌的相關(guān)研究。吳獻(xiàn)忠等[26]對(duì)來(lái)自山東的16株大麗輪枝菌的致病力研究將其分為強(qiáng)致病力(與落葉型相似)、中等致病力和弱致病力，并發(fā)現(xiàn)山東省有落葉型菌系存在。落葉型大麗輪枝菌因其發(fā)病快、致病力強(qiáng)近年來(lái)逐漸成為棉花黃萎病的優(yōu)勢(shì)種群[27-30]。自從其被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，科研工作者一直致力于探討落葉型大麗輪枝菌引起寄主落葉的分子機(jī)理。通過(guò)隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增(RAPD)確定落葉型菌株有一段長(zhǎng)為 0.55 kb的特異序列，這為分子標(biāo)記在黃萎病流行病學(xué)方面提供了新思路[31]。同時(shí)，對(duì)大麗輪枝菌致病基因挖掘與功能鑒定?；蚪M功能分析等方面開展相關(guān)研究，進(jìn)一步推動(dòng)了大麗輪枝菌病源學(xué)、流行病學(xué)、病原與寄主互作機(jī)制研究的發(fā)展[32-34]。Zhang等[35]通過(guò)比較基因組學(xué)鑒定出高致病力的落葉型菌株有一段LSR(lineage-specific regions)區(qū)編碼的7個(gè)VdDfs基因，該區(qū)域在低致病非落葉型菌株基因組中基本完全缺失。通過(guò)對(duì)這7個(gè)基因結(jié)構(gòu)域分析表明 VdDfs基因簇為一個(gè)典型的次生代謝物合成基因簇，該基因簇產(chǎn)生的次級(jí)代謝物N-?；掖及?NAEs)[36]。研究表明(NAEs)可以與ABA相互作用發(fā)揮生物學(xué)功能[37]。植物落葉是一個(gè)自然而復(fù)雜的生理過(guò)程，涉及生理、生化和分子網(wǎng)絡(luò)等多個(gè)調(diào)控系統(tǒng)[38-41]。有研究表明，在水壓力脅迫和一些不良環(huán)境脅迫下，ABA的產(chǎn)生會(huì)顯著上調(diào)，從而可以調(diào)節(jié)葉片脫落[42-43]。一直以來(lái)認(rèn)為一些低等病原物不能合成ABA，直到最近研究發(fā)現(xiàn)病原菌侵染后植物葉片ABA水平會(huì)上升，主要原因是病原菌自身合成ABA的水平提高所致。雖然病原菌只合成少量的ABA，但可以觸發(fā)植物對(duì)外界環(huán)境的生理反應(yīng)[44]。當(dāng)灰葡萄孢霉菌侵染番茄后，番茄葉片的ABA是未接菌處理的10倍多。研究者將ABA的合成分為4步：侵染時(shí)寄主誘導(dǎo)病原菌ABA合成，接著病原菌釋放ABA或者ABA前體物，此時(shí)植物體內(nèi)的ABA產(chǎn)量逐漸積累，同時(shí)病原菌自身有抑制ABA代謝。相比只接菌，ABA和病原菌孢子共同處理后番茄葉片會(huì)更快的出現(xiàn)壞死現(xiàn)象[45]。因此植物的抗病程度與ABA合成相關(guān)。在擬南芥中，ABA合成相關(guān)基因aba2-1突變體對(duì)鐮刀菌的抗性顯著增強(qiáng)[46]。而aba-1突變體對(duì)疫霉菌和丁香假單胞菌的抗性明顯減弱，植物葉片枯黃，脫落[47]。然而目前有關(guān)ABA合成與落葉型大麗輪枝菌引起棉花落葉之間關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。本研究中，大麗輪枝菌ABA合成相關(guān)基因Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba2(2)和Vdaba4不影響大麗輪枝菌XJ592引起的棉花落葉，但影響大麗輪枝菌的產(chǎn)孢能力、菌落生長(zhǎng)及致病力等，說(shuō)明ABA合成相關(guān)基因在病原菌引起的落葉過(guò)程中并不發(fā)揮功能，而對(duì)大麗輪枝菌的生理生長(zhǎng)與致病過(guò)程起到至關(guān)重要的作用?？赡蹵BA在生物因素引起的落葉過(guò)程和非生物脅迫引起的落葉過(guò)程中發(fā)揮不同的生物功能。

大麗輪枝菌ABA合成基因Vdaba1的敲除對(duì)大麗輪枝菌的產(chǎn)孢量有顯著的抑制作用，說(shuō)明Vdaba1參與大麗輪枝菌的產(chǎn)孢過(guò)程，Vdaba1敲除突變體菌株的病情指數(shù)下降，可能是由于孢子產(chǎn)量減少導(dǎo)致的。本研究△Vdaba4突變體接菌棉花后，致病力減弱，說(shuō)明Vdaba4也參與大麗輪枝菌致病過(guò)程。同時(shí)發(fā)現(xiàn)△Vdaba4突變體菌株對(duì)H2O2壓力更敏感，說(shuō)明Vdaba4基因在大麗輪枝菌抵抗氧化壓力中起促進(jìn)作用。這可能是△Vdaba4突變體導(dǎo)致大麗輪枝菌致病性減弱的原因之一?；騐daba2(1)和Vdaba2(2)對(duì)大麗輪枝菌的致病性沒有影響，卻對(duì)大麗輪枝菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)起正向調(diào)控作用。因此大麗輪枝菌ABA合成基因Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba2(2)和Vdaba4在調(diào)節(jié)大麗輪枝菌的生長(zhǎng)和致病性方面行使不同的功能。前人研究表明，病原菌侵染植物寄主時(shí)，可以產(chǎn)生許多次級(jí)代謝物，而且真菌通常是以基因簇的形式參與次級(jí)代謝物的形成[48]。病原菌ABA的產(chǎn)出通過(guò)遠(yuǎn)距離的運(yùn)輸與轉(zhuǎn)移，參與病原菌致病侵染過(guò)程[12]。

ABA在響應(yīng)各種不良環(huán)境中發(fā)揮重要作用，如在各種非生物脅迫干旱、水等不適條件中，ABA的產(chǎn)生可以幫助植物度過(guò)不良環(huán)境[38-39]。但在大麗輪枝菌引起的棉花落葉方面，ABA合成相關(guān)基因敲除沒有發(fā)揮決定作用。一方面本研究中通過(guò)NCBI比對(duì)灰葡萄孢霉菌ABA合成相關(guān)基因，并不是落葉型大麗輪枝菌ABA合成所特有的基因，不同真菌ABA合成過(guò)程可能存在差異。另一方面在這個(gè)研究中只做了單基因敲除，大麗輪枝菌ABA合成過(guò)程可能存在基因冗余的情況，致使突變體接菌棉花也表現(xiàn)出落葉表型，需要進(jìn)一步開展雙敲除、三敲除甚至四敲除突變體研究，測(cè)試他們對(duì)棉花落葉性狀的影響。