于素香 馬為靈 王斌 白云 張金庫

宮頸病變是一類疾病的統(tǒng)稱，包括子宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)1、CIN2、CIN3等，隨著病情不斷發(fā)展，可演變?yōu)樵话1]。研究表明，子宮頸癌(CC)的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段過程，經(jīng)良性病變、CIN、鱗狀上皮癌變的遞進(jìn)過程，亦涉及多個(gè)途經(jīng)的改變，造成細(xì)胞增殖失控[2]。P16是一種抑癌基因，能直接作用于細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞分裂基因。正常細(xì)胞內(nèi)P16蛋白較少，但是在宮頸鱗狀細(xì)胞癌(CSCC)病人中，其表達(dá)水平較高，能引起細(xì)胞周期調(diào)節(jié)紊亂，使細(xì)胞無限增殖[3-4]。Ki67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其陽性率越高，腫瘤生長越快，能判斷腫瘤細(xì)胞活躍程度[5]。本研究以老年宮頸病變病人為對(duì)象，探討P16和Ki67在老年宮頸病變病人中的表達(dá)水平及其聯(lián)合檢測的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年5月至2019年5月老年宮頸病變病人200例作為研究對(duì)象，根據(jù)病理類型分為CSCC組、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)組及子宮肌瘤組(正常組)。CSCC組53例，年齡60～79歲，平均(68.19±4.61)歲，腫瘤直徑1～6 cm，平均(3.29±0.61)cm;臨床分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期23例。HSIL組85例，年齡60～80歲，平均(69.06±5.61)歲。正常組62例，年齡60～81歲，平均(70.04±4.68)歲；病程1～7年，平均(3.25±0.56)年；肌瘤直徑1～8 cm，平均(3.31±0.65)cm。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，病人和(或)家屬均簽署同意書。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合宮頸病變診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，均經(jīng)陰道鏡檢查確診；(2)擬行手術(shù)檢查，且病人能完成P16及Ki67蛋白測定，可耐受；(3)意識(shí)清楚，能與醫(yī)生及進(jìn)行溝通、交流。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并精神異常、血液系統(tǒng)疾病或器質(zhì)性疾病者；(2)合并凝血功能異常、其他部位確診的惡性腫瘤者；(3)手術(shù)前行放化療、生物免疫治療者。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：病人均擬行手術(shù)治療，術(shù)中取病灶，術(shù)后將獲取的標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制備4μm切片，備用。

1.3.2 測定P16、Ki67蛋白表達(dá)情況： 采用免疫組織化學(xué)法測定不同組織中P16、Ki67蛋白陽性率。向制備的切片中加入3%甲醇雙氧水，持續(xù)處理10 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS連續(xù)完成5 min洗滌，連續(xù)洗滌3次；加入PBS調(diào)整整體溶液pH值為6.0，加入檸檬酸鹽緩沖液，緩慢加熱，完成缺損蛋白修復(fù)。向標(biāo)本中加入山羊血清完成20 min封閉，加入MDR1、ToPoⅡα、PTER、Livin蛋白一抗，PBS洗滌后緩慢加熱，并加入MDR1、ToPoⅡα、PTER、Livin二抗，在濕盒內(nèi)孵育30 min，37 ℃下加入PBS洗滌，利用DAB顯色后顯微鏡下拍照。

1.3.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)：免疫組化完畢后，倒置顯微鏡下觀察結(jié)構(gòu)完整、清晰且定位較為明確的細(xì)胞；細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)呈棕色，顏色明顯高于背景[7-8]，即為陽性細(xì)胞。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo) 根據(jù)各組P16、Ki67陽性表達(dá)情況，繪制ROC曲線，分析P16聯(lián)合Ki67在老年婦女宮頸病變臨床診斷中的效能。

2 結(jié)果

2.1 3組P16、Ki67蛋白陽性率比較 CSCC組P16、Ki67蛋白陽性率均高于HSIL組和正常組(P<0.05)；HSIL組P16、Ki67蛋白陽性率均高于正常組(P<0.05)，見表1。

表1 3組P16、Ki67蛋白陽性率比較(n，%)

2.2 3組P16、Ki67蛋白免疫組化結(jié)果 免疫組化結(jié)果表明，CSCC組P16、Ki67蛋白表達(dá)水平較高，細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)呈棕黃色，且顏色明顯高于背景；HSIL組P16、Ki67蛋白呈淡黃色，顏色較淡；正常組P16、Ki67蛋白表達(dá)較少或不表達(dá)，見圖1和圖2。

注：A為正常組；B為HSIL組；C為CSCC組圖1 不同組織中Ki67蛋白免疫組化結(jié)果(×200)

注：A為正常組；B為HSIL組；C為CSCC組圖2 不同組織中P16蛋白免疫組化結(jié)果(×200)

2.3 P16聯(lián)合Ki67在宮頸病變臨床診斷中的效能 ROC曲線分析結(jié)果表明，P16聯(lián)合Ki67(聯(lián)合檢測時(shí)一項(xiàng)陽性即為陽性)(AUC為0.913)在宮頸病變診療中的敏感度、陰性預(yù)測值高于單一P16(AUC為0.866)、Ki67(AUC為0.835)，特異度低于單一P16、Ki67；不同檢測方法陽性預(yù)測值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2，圖3。

表2 P16聯(lián)合Ki67在宮頸病變中的效能

圖3 P16聯(lián)合Ki67在宮頸病變中的診斷ROC曲線

3 討論

CSCC是臨床上較為常見的婦科惡性腫瘤，可分為外生型、內(nèi)生型、潰瘍型及頸管型4種，好發(fā)于40～50歲人群中[9]。隨著我國人口老齡化的日益加劇，宮頸癌在老年人群中檢出率不斷上升，可能與病人長期的慢性宮頸疾病有關(guān)，導(dǎo)致病人病情惡化或發(fā)生癌變。因此，加強(qiáng)老年婦女宮頸病變病人診斷、鑒別診斷對(duì)改善病人預(yù)后具有重要的意義[10]。

根據(jù)《女性生殖器官腫瘤分類》[11]，推薦將P16作為低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、HSIL診斷的分子生物學(xué)指標(biāo)。本研究中，CSCC組P16、Ki67蛋白陽性率均高于HSIL組和正常組(P<0.05)；HSIL組P16、Ki67蛋白陽性率均高于正常組(P<0.05)，說明P16、Ki67蛋白在CSCC組織中陽性率較高，可能直接參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展主要與細(xì)胞的過度增殖與凋亡的減少有關(guān)[12]。而Ki67作為細(xì)胞增殖核抗原，屬于增殖抗原中具有代表性的細(xì)胞增殖標(biāo)記之一，其表達(dá)水平與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等有關(guān)，加強(qiáng)其表達(dá)水平測定能判斷病人病情發(fā)展情況[13]。本研究中，免疫組化結(jié)果表明，P16、Ki67在CSCC組織中表達(dá)水平較高，而在HSIL組織中處于中等表達(dá)水平，在正常組織中陽性率較低或不表達(dá)，能實(shí)現(xiàn)疾病的鑒別。進(jìn)一步分析P16聯(lián)合Ki67檢測在老年婦女宮頸病變病人中的診斷價(jià)值，結(jié)果表明，P16聯(lián)合Ki67(聯(lián)合檢測時(shí)一項(xiàng)陽性即為陽性)在宮頸病變診療中的敏感度、陰性預(yù)測值高于單一P16、Ki67,特異度低于單一P16、Ki67；不同檢測方法的陽性預(yù)測值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，老年婦女宮頸病變病人中可加強(qiáng)P16聯(lián)合Ki67蛋白測定，對(duì)于測定結(jié)果陽性病人可適當(dāng)擴(kuò)大切除范圍；亦可根據(jù)測定結(jié)果指導(dǎo)術(shù)后治療，鞏固手術(shù)效果，促進(jìn)病人早期恢復(fù)[14]。

綜上所述，P16、Ki67在老年婦女宮頸病變病人中表達(dá)異常，聯(lián)合檢測P16和Ki67能幫助實(shí)現(xiàn)不同疾病的鑒別，其具有較高的靈敏度，可指導(dǎo)臨床治療，值得推廣應(yīng)用。