唐 昊，鄭 莉,張 羽，李沅秋，羅朝兵

(1.樂山師范學院生命科學學院，四川樂山 614000；2.竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點實驗室，四川樂山 614000)

0 引言

WRKY轉錄因子是植物中的調(diào)節(jié)蛋白中的一個大家庭，WRKY轉錄因子約有60個高度保守的氨基酸，其特征為N端WRKYGQK基序和C端CCHC- (C2HC)或CCHH- (C2H2)型鋅指基序，WRKY蛋白通過與基因啟動子中的W-BOX motif (TTGACC/T)結合來調(diào)控基因表達[1-4].同時根據(jù)WRKY結構域的數(shù)量和鋅指基序的特征，可以劃分為三個主要的家族[1-3]，其中家族Ⅰ具有兩個典型的WRKY結構域和一個C2H2-型鋅指基序，而其他大多數(shù)的WRKY蛋白只含有一個WRKY結構域，歸屬于家族II或家族Ⅲ，家族II的鋅指基序與家族Ⅰ相同，家族Ⅲ的鋅指基序為C2HC.此外，家族II中的WRKY蛋白可以進一步分為IIa 、 IIb、IIc、IId 和IIe五個亞族，而家族III中WRKY蛋白分為IIIa和IIIb亞族[3,5].大量的WRKY轉錄因子在多種植物的基因組中被發(fā)現(xiàn)并鑒定，例如擬南芥[1]，水稻[6]，玉米[7]和小麥[8]等.同時遺傳和分子生物學研究表明，WRKY轉錄因子在植物中一方面參與抵御諸如細菌[9-11]、真菌[12-13]、病毒病原體[14]及病毒[15]各種生物脅迫的調(diào)控中起著關鍵作用；另一方面也在響應如干旱脅迫[8,16-18]、水脅迫[19]、鹽脅迫[20]和寒冷脅迫[21-22]等非生物脅迫時的植物體內(nèi)的調(diào)控.此外，WRKY轉錄因子還能參與植物自身的生長發(fā)育調(diào)控，如葉片的衰老調(diào)控[23-24]、開花調(diào)控[25-27]、細胞內(nèi)信號轉導[28]、植物種子的發(fā)育及毛狀體起始和衰老[3,29].

慈竹(Bambusaemeiensis)屬于叢生竹類，廣泛分布于我國南方地區(qū)，被廣泛應用于造紙及園林綠化等領域[30].其中在造紙領域，按照竹種對造紙質(zhì)量的影響進行分級排序，竹種可以被分為四級，而慈竹屬于最重要的第一級[31].長足大竹象(Cyrtotrachelusbuquet)是主要的竹林害蟲之一，屬于鞘翅目象甲科.成蟲期的長足大竹象可將喙完全的伸入幼嫩竹筍內(nèi)部, 取食竹腔內(nèi)層的幼嫩組織[32]，造成新竹生長不良或形成膿包竹，引起竹腔變黑、腐爛，造成大量退筍，這將極大的影響了慈竹的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[33-34].

根據(jù)目前的研究現(xiàn)狀，對于慈竹而言，其目前尚未有基因組草圖公布，且暫未有慈竹在長足大竹象取食脅迫下的WRKY轉錄因子的研究.因此本文結合長足大竹象取食脅迫狀態(tài)下慈竹轉錄組的測序及生物信息學分析，對慈竹中WRKY轉錄因子進行鑒定及分析，以期發(fā)現(xiàn)WRKY轉錄因子在慈竹抗蟲害表征中所發(fā)揮的作用，同時為研究慈竹WRKY轉錄因子結構和功能提供信息參考.

1 材料與方法

1.1 植物和長足大竹象材料的準備和處理

新鮮慈竹竹筍樣本采集于四川省樂山市沐川縣.長足大竹象(C.buqueti)于2017年8月收集于四川省沐川縣，成蟲在出土后三日喂養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中(保持26℃恒溫和70%的濕度，并維持16 h的光照及8 h的黑暗處理).在試驗處理前，使長足大竹象保持饑餓狀態(tài)24 h.

取100只饑餓處理后長足大竹象成蟲置于新鮮竹筍上，分為長足大竹象未取食的竹筍部位(Group1)及同一竹筍上長足大竹象取食的竹筍部位(Group3)及同一叢竹筍中另一竹筍上長足大竹象完全未取食的竹筍部位(Group2)三個組，Group1和Group2取樣的部位盡量保持在不同竹筍上近似的部位.實驗的詳細處理方法參照李沅秋等的實驗方法[35].

1.2 慈竹轉錄組中WRKY轉錄因子序列的獲得

提取慈竹竹筍RNA，經(jīng)質(zhì)量檢測后用Illumina HiSeqTM2000平臺測序.將測序得到的原始數(shù)據(jù)過濾掉低質(zhì)量和冗余的Reads讀段后，采用 Trinity 軟件進行數(shù)據(jù)的從頭組裝及拼接，最終得到慈竹的轉錄本 Transcripts并從中選取最主要的轉錄本作為 Unigene序列，進一步并對 Unigene 數(shù)據(jù)去冗余處理并得到非冗余 Unigene 庫.對Unigene序列進行基因功能注釋[36,37].根據(jù)注釋結果搜索“WRKY transcription factor”，查找注釋相關的Unigene名稱，手動調(diào)取 Transcript.fa中上述Unigene序列，去除掉序列小于200bp的Unigene基因序列信息.

1.3 慈竹WRKY轉錄因子家族成員的鑒定及其蛋白質(zhì)的性質(zhì)分析

利用ORFFinder( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)功能查找每個基因的ORF，只保留氨基酸殘基數(shù)大于100的相應核苷酸序列作進一步分析.利用ProtParam程序(http://web.expasy.org/protparam/)對WRKY蛋白進行相關性質(zhì)參數(shù)的預測[38].

1.4 系統(tǒng)進化樹的構建及保守motif 的分析

在Plant Transcription Factor Database(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/.)中下載擬南芥(Arabidopsisthaliana)WRKY蛋白序列，使用DNAMAN6.0及MEGA 7.0軟件對慈竹及山羊草的WRKY蛋白進行多序列比對，然后在MEGA 7.0軟件中的系統(tǒng)進化樹構建方法中選用鄰接法并設置1000次重復bootstrap檢驗、Poisson模型構建WRKY蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹[39-40].利用在線網(wǎng)站(http://meme-suite.org/index.html)并使用默認參數(shù)設置對WRKY轉錄因子蛋白進行motif分析[41].

1.5 慈竹WRKY表達模式

根據(jù)慈竹轉錄組數(shù)據(jù)中鑒定出的WRKY轉錄因子相對表達量的豐度值，將值導入 MeV 4.9.0分析軟件中，繪制熱圖并進行聚類分析[42].

2 結果與分析

2.1 WRKY轉錄因子蛋白的性質(zhì)分析

根據(jù)ORFFinder查找結果，從慈竹轉錄組中篩選出29個大于100個氨基酸的ORF序列.這些WRKY蛋白的ORF的氨基酸含量差別較大，最長ORF的氨基酸數(shù)從153(comp46865_seq1)到688(comp7071_seq3)；相對分子量位于16234.32 Da(comp46865_seq1)到74034.74 Da(comp7071_seq3)之間；等電點介于4.89(comp55566_seq0)到10.15(comp46865_seq1)之間；此外，蛋白質(zhì)的親水性總平均值結果表明慈竹WRKY 蛋白大多為親水性蛋白質(zhì)(表1).

表1 慈竹WRKY 蛋白的相關性質(zhì)分析Tab.1 Analysis of the related properties of the WRKY protein in Bambusa emeiensis

2.2 慈竹WRKY轉錄因子蛋白的結構域分析

使用DNAMAN6.0軟件對初步鑒定出的29條慈竹WRKY轉錄因子蛋白進行多序列比對，結果如下：在29條WRKY蛋白質(zhì)序列中，有4條序列C端缺失(comp9372_seq1、comp17764_seq1、comp34208_seq1及comp51858_seq0)，主要原因或為轉錄組數(shù)據(jù)拼接不完整所致；其余25條具有完整WRKY轉錄因子蛋白質(zhì)結構域的序列中，有8條序列C端為CCHC型鋅指結構，17條為C端CCHH型鋅指結構；在N端， comp34208_seq1的WRKYGQK基序變?yōu)榱薟PKYGSQK，存在著2個氨基酸殘基的變異.此外，comp5390_seq0和comp51858_seq0轉錄因子的WRKYGQK基序中，Q(谷氨酰胺)被K(賴氨酸)所替代(圖1).

圖1 慈竹WRKY轉錄因子序列比對分析Fig.1 Sequence alignment of Bambusa emeiensis WRKY transcription Factor

2.3 慈竹及擬南芥WRKY轉錄因子的系統(tǒng)進化樹構建

圖2 慈竹與擬南芥WRKY轉錄因子的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of WRKY Transcription Factor in Bambusa emeiensis and Arabidopsis thaliana

為進一步對慈竹WRKY轉錄因子的進化關系進行分析，從Plant Transcription Factor Database下載了41條擬南芥(Arabidopsisthaliana)WRKY轉錄因子的蛋白質(zhì)序列，利用MEGA 7.0軟件中CLUSTAL參數(shù)對這70條WRKY蛋白序列進行比對，繪制出慈竹WRKY 轉錄因子的進化樹(圖2).

根據(jù)系統(tǒng)進化樹的分析結果，可以將70條序列分為3個家族.其中家族Ⅰ(Group 1)含有6個慈竹WRKY轉錄因子序列，家族II(Group 2)含有包括5個亞族，共有15個WRKY轉錄因子序列.家族III(Group 3)包含8個序列慈竹WRKY轉錄因子.

2.4 慈竹WRKY家族motif分析

利用MEME分析慈竹WRKY的motif(圖3)，結果發(fā)現(xiàn)所有慈竹WRKY轉錄因子均含有motif1，其序列包含WRKYGQK基序，這與多序列比對結果相吻合(圖1).

此外、comp34208_seq1、comp9372_seq1、comp17764_seq1缺失motif3和motif5，導致它們的C端CCHC- (C2HC)或CCHH- (C2H2)型鋅指基序的缺失，可能原因是在進行序列拼接時組裝不完善所致.

2.5 慈竹WRKY基因表達分析

目前尚未有慈竹WRKY轉錄因子在蟲害(長足大竹象)取食脅迫下基因表達量變化的研究，根據(jù)本試驗的結果(圖4)：在不同竹筍的未被取食部位(Group1與Group2)，WRKY轉錄因子在慈竹中表達量基本接近，而在同一根竹筍的取食與未被取食部位(Group1與Group3)，comp5294_seq2、comp7144_seq0、comp4915_seq1、comp1871_seq0、comp5390_seq0、comp26614_seq1、comp30333_seq1等WRKY轉錄因子表達量存在著較大的變化，表明這幾個WRKY轉錄因子可能對慈竹抵御蟲害有重要作用.

圖3 慈竹WRKY轉錄因子motif分析Fig.3 Analysis of Bambusa emeiensisWRKY transcription factor motif圖4 長足大竹象取食脅迫下慈竹WRKY轉錄因子的表達模式分析Fig.4 Analysis of expression patterns of Bambusa emeiensis WRKY transcription factors under under the Cyrtotrachelus buquet feeding-stress

3 討論與結論

WRKY因子通常被認為是存在的植物特異性，但在馴化和多倍體化的選擇過程中，野生和栽培植物中都保留了重復的WRKY轉錄因子[43].此外，WRKY轉錄因子被發(fā)現(xiàn)與倍間雜交種的生存能力有關[44].系統(tǒng)發(fā)育序列分析和比較轉錄組學表明，它們在單子葉植物和雙子葉植物之間保留了各自的功能[45].WRKY轉錄因子家族在多種模式植物的基因組中被發(fā)現(xiàn)并鑒定，如擬南芥[1]，水稻[6]和玉米[7]等.在慈竹中，劉紅梅等鑒定了兩個 WRKY轉錄因子，它們主要參與慈竹對逆境的響應及干旱和ABA(脫落酸)的脅迫響應[46],而對于慈竹中WRKY轉錄因子在遭受蟲害(長足大竹象)時其相關研究尚未有報到.在本研究中，comp5294_seq2、comp7144_seq0、comp4915_seq1、comp1871_seq0、comp1486_seq1、comp6576_seq0、comp5390_seq0、comp26614_seq1、comp30333_seq1在長足大竹象取食之后表達量存在較大的變化.根據(jù)系統(tǒng)進化樹的結果，comp1871_seq0、comp7144_seq0、comp6576_seq0與擬南芥WRKY70轉錄因子親緣關系較近，而在擬南芥中的研究表明WRKY70是植物對病原菌響應過程中水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)介導的信號事件的匯聚節(jié)點，且在決定依賴于SA和依賴于JA的防御途徑之間的平衡中起著關鍵作用[47].對于comp1486_seq1，其與擬南芥的WRKY13的轉錄因子存在較高的同源性，而WRKY13在擬南芥中促進了莖的整體發(fā)育，因為WRKY13突變體的厚壁組織細胞數(shù)量、莖粗和維管束數(shù)量均減少.WRKY13突變體中木質(zhì)素合成相關基因被抑制，導致莖稈較弱[48]，因此，comp1486_seq1在慈竹被長足大竹象取食時其表達量的上調(diào)可能與促進慈竹筍的發(fā)育來提升對蟲害脅迫的抗性.除此之外，comp5390_seq0 與擬南芥的WRKY51轉錄因子及comp5294_seq2與擬南芥的WRKY60轉錄因子均存在較高的同源性, 而WRKY51蛋白介導了在低油酸(18:1)條件下JA介導的信號抑制[49]， WRKY60和WRKY40的共表達作用使植物對丁香假單胞菌和灰葡萄孢的抗性增強[50].根據(jù)上述結果，我們推測慈竹在遭受蟲害的生物脅迫時，慈竹基因組內(nèi)的WRKY轉錄因子可能參與了由SA合JA介導的信號轉導(如comp1871_seq0、comp7144_seq0、comp6576_seq0、comp5390_seq0)及通過慈竹筍發(fā)育相關的WRKY轉錄因子(comp1486_seq1)表達量的上調(diào)來響應蟲害的脅迫.

此外，本文從慈竹的蟲害脅迫的轉錄組數(shù)據(jù)中鑒定了29個慈竹轉錄因子，其中26個WRKY轉錄因子具有完整的結構域，通過對其表達模式的分析可為以慈竹中WRKY轉錄因子如何響應長足大竹象取食脅迫及慈竹蟲害的防控方面提供部分理論依據(jù).