郭華榮，陶奕文

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋生物遺傳與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2. 中國海洋大學(xué)海洋生物進(jìn)化與多樣性研究所，山東 青島 266003)

甲殼動物是節(jié)肢動物門中的一個亞門，因體表有一層幾丁質(zhì)外殼而得名。甲殼動物的種類有2.6萬種之多，大多數(shù)生活在海洋里，少數(shù)棲息在淡水中和陸地上。其中的蝦蟹類營養(yǎng)豐富，味道鮮美，是重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種。而另外一些小型甲殼動物則成為魚類等經(jīng)濟(jì)動物的餌料或生態(tài)環(huán)境指示生物，在水生食物鏈中占有重要地位。

隨著越來越多的甲殼動物全基因組序列的公布[1-2]，其生長、發(fā)育和免疫等重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因的生物學(xué)功能的研究也引起了人們更多的關(guān)注。而CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)因其操作簡便、快速和成本低的特點，也迅速在少數(shù)幾種水生甲殼動物中得到了成功應(yīng)用[3-8]。但是由于顯微注射技術(shù)在應(yīng)用上的局限性，導(dǎo)致該技術(shù)在許多重要海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種如對蝦中的應(yīng)用受到限制，基因編輯效率低下，難以廣泛開展。本文對CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在水生甲殼動物中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述和展望，為今后海水養(yǎng)殖蝦蟹類的基因功能研究以及遺傳育種研究提供參考。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)簡介

CRISPR/Cas9英文全稱為Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9，即成簇的有規(guī)律地間隔排列的短回文重復(fù)序列及其核酸酶9。CRISPR簇是一個廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中的特殊的DNA重復(fù)序列，由一個前導(dǎo)區(qū)(Leader)、多個短而高度保守的重復(fù)序列區(qū)(21～48 bp，參與發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成)和多個間隔區(qū)(Spacer，26～72 bp，來源于入侵的病毒和質(zhì)粒的基因組)組成。CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌中較為有效的一種獲得性免疫系統(tǒng)：細(xì)菌-病毒(噬菌體)[9-11]。這一發(fā)現(xiàn)完全顛覆了人們關(guān)于獲得性免疫的概念，即并非只有抗體可以實現(xiàn)免疫記憶，生命在其非常原始的形態(tài)時如細(xì)菌，就已經(jīng)學(xué)會利用堿基的互補(bǔ)配對原則，在核酸水平上實現(xiàn)了這種免疫記憶，只是后來進(jìn)化了，有了更多的細(xì)胞分工和蛋白合成能力，才發(fā)展出抗體而取代了這一機(jī)制。細(xì)菌在與噬菌體的斗爭中發(fā)展出了CRISPR/Cas系統(tǒng)，當(dāng)細(xì)菌被噬菌體侵染后，要么死掉，要么戰(zhàn)勝噬菌體。而勝利活下來的細(xì)菌會將噬菌體的一小段DNA片段插入自己的重復(fù)序列區(qū)中，成為一個新的間隔序列。當(dāng)該病毒DNA再次進(jìn)入細(xì)菌時，它就會被間隔序列所轉(zhuǎn)錄的gRNA(guide RNA)所識別，并激活與其結(jié)合的Cas核酸酶，切割入侵病毒的DNA雙鏈，從而實現(xiàn)保護(hù)自身安全和防御入侵的目的[12-14]。

人們利用細(xì)菌中這一靶向切割基因組DNA的機(jī)制設(shè)計了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，以實現(xiàn)對靶基因功能的分析[15-17]。其中，Cas蛋白有10多種，但由于Cas9的酶活性較高，且不需其它蛋白的輔助，因而最先被選中。在CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中，如圖1所示，最初設(shè)計的CRISPR是由一個基因特異性的CRISPR RNA (crRNA，即gRNA)和一個反式激活CRISPR RNA (tracrRNA，即gRNA scaffold) 形成的短雙鏈RNA: crRNA/tracrRNA，其與Cas9蛋白結(jié)合形成核糖核蛋白體(Ribonucleoprotein，RNP)，利用其中的gRNA與靶基因的互補(bǔ)結(jié)合，從而引導(dǎo)Cas9核酸酶切割靶基因的DNA雙鏈。后來，Jinek等(2012)發(fā)現(xiàn)將crRNA和tracrRNA串聯(lián)形成的單個嵌合gRNA(Single gRNA，sgRNA)也可以行使雙鏈crRNA/tracrRNA的作用，從而大大簡化操作[17]。因此，之后的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)主要由cas9和sgRNA兩個基因編輯元件組成。當(dāng)cas9和sgRNA作用于靶序列，形成DNA雙鏈斷裂后，將激活細(xì)胞內(nèi)的兩種DNA修復(fù)機(jī)制：同源重組修復(fù)(HDR)和非同源末端連接(NHEJ)。當(dāng)NHEJ參與斷裂基因的修復(fù)時，可引起基因的移碼突變，導(dǎo)致靶基因的敲除；當(dāng)系統(tǒng)中加入其它外源基因片段時，這些外源基因片段就有很大可能被插入靶位點，從而實現(xiàn)基因的敲入。

另外，Cas9核酸酶含有2個酶切活性位點：HNH 和RuvC-like，分別負(fù)責(zé)切割DNA雙鏈的互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈。Cas9核酸酶切割的位點為間隔序列鄰近基序(Protospacer adjacent motif，PAM) 之前的第4個核苷酸處(見圖1)。PAM序列具有種屬的特異性，例如來自于釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的SpCas9的PAM序列為NGG，而來自于金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的SaCas9的PAM序列為NNGRRT/NNGRRN(R指A/G)，來自狗鏈球菌Streptococcuscanis的ScCas9的PAM序列為NNGN，僅需1 個G[18]。PAM序列不屬于gRNA，而是gRNA 3’末端的緊鄰序列，PAM序列的存在是激活Cas9的酶活性所必需的，只有DNA靶位點附近存在PAM時，Cas9才能準(zhǔn)確切割。

總之，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是一種由gRNA引導(dǎo)的Cas9核酸酶靶向編輯技術(shù)，其操作簡便快速，成本低，已廣泛用于基因的敲除、插入和敲降。自2013年首次應(yīng)用于真核細(xì)胞的基因編輯以來，以日新月異的速度在不斷發(fā)展[19-20]。不僅廣泛應(yīng)用于基因功能的研究和疾病的治療[21-22]，還在模式生物中用于快速制備突變個體，研究生長和發(fā)育的機(jī)制以及遺傳學(xué)規(guī)律[23-24]，以及重要經(jīng)濟(jì)物種優(yōu)良性狀的改良[25-26]。

圖1 雙鏈crRNA/tracrRNA(a)和單鏈sgRNA(b)引導(dǎo)的Cas9核酸酶靶向切割DNA雙鏈?zhǔn)疽鈭D[17]Fig.1 Schematic diagram of the targeted deawage of double-strand DNA by Cas9 nndease which is guided by double-strand crRNA/tracrRNA(left)and single strand RNA(Right)

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的效率問題

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的核心元件為sgRNA和Cas9，大量研究表明，sgRNA的準(zhǔn)確靶向、Cas9蛋白的高效表達(dá)以及基因編輯元件的有效遞送是決定該技術(shù)的靶向性和基因編輯效率的三個關(guān)鍵因素[27]。其中，將基因編輯元件高效遞送到靶細(xì)胞內(nèi)是實現(xiàn)基因編輯的前提條件。目前，上述基因編輯元件的遞送可以通過物理方法如顯微注射和電穿孔等，也可以通過生物學(xué)方法，以病毒載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒等)或非病毒載體(即表達(dá)質(zhì)粒)介導(dǎo)[28]。目前，在模式動物中上述基因編輯元件的遞送方法已很成熟。其中，顯微注射到小鼠、斑馬魚和果蠅等的受精卵/早期胚胎中，或者線蟲的生殖腺中是應(yīng)用最廣泛、最成功的遞送方式[23,29-31]。在分裂活躍的哺乳動物、魚類和昆蟲的體外培養(yǎng)細(xì)胞系中，也有各種有效的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法以及病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移與表達(dá)系統(tǒng)，可以用來遞送上述基因編輯元件[32-35]。但是，對于眾多非模式動物來說，往往由于缺乏有效的基因編輯元件遞送工具，而嚴(yán)重限制了CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用[ 3,36]。

目前，sgRNA和Cas9的遞送形式主要有三種：(1) DNA質(zhì)粒，即編碼sgRNA和Cas9的表達(dá)質(zhì)粒；(2) RNA形式，即體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA和sgRNA；(3) RNP形式，即sgRNA和Cas9蛋白復(fù)合物。相比較而言，以DNA質(zhì)粒為遞送形式，操作簡單，且編輯作用持續(xù)的時間更長，但編輯效率要受到靶細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和表達(dá)sgRNA與Cas9的效率的限制；以RNA或RNP為遞送形式，編輯作用更快，但是需要體外制備上述編輯元件[3]。

sgRNA的準(zhǔn)確靶向和降低脫靶率是CRISPR/Cas9基因編輯效率方面的另一備受關(guān)注的問題。為此，科學(xué)家們將Cas9蛋白的其中一個活性位點突變，構(gòu)建dCas9(dead Cas9)突變體，以實現(xiàn)對靶基因單鏈的切割。然后通過在靶位點的互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈上分別設(shè)計兩個gRNA，二者相距不超過20 bp，以單鏈缺刻(nick)的形式打斷靶基因雙鏈，可以顯著提高編輯的效率，減少脫靶率。也有科學(xué)家將Cas9的兩個酶切活性位點全部突變，使其失去切割DNA活性，但是保留結(jié)合gRNA的能力，但是將其標(biāo)記上報告基因如GFP或轉(zhuǎn)錄因子等，則可以實現(xiàn)靶基因的細(xì)胞定位和實時示蹤。另外，科學(xué)家們通過改變了組成spCas9蛋白的1 400個氨基酸中的3個氨基酸，成功將脫靶效應(yīng)降低到了幾乎無法檢測的水平[37]。也有人通過縮短sgRNA的長度，制造sgRNA近PAM的3’端核心序列的單堿基差異以及改變Cas9蛋白的構(gòu)象等方式有效提高了基因編輯的靶向性，降低脫靶率[38-39]。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在水生甲殼動物中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在節(jié)肢動物中，特別是昆蟲中已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用[32,36]。近幾年，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在少數(shù)幾種水生甲殼動物如鰓足類中的大型蚤(Daphniamagna)和蚤狀溞(D.pulex)、片腳類中的夏威夷明鉤蝦(Parhyalehawaiensis)以及十足類中的脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)中也得到了很好的應(yīng)用[2-3,5-8]。這些甲殼動物均為抱卵，早期胚胎能夠耐受顯微注射操作?？梢哉f，CRISPR/Cas9技術(shù)在上述水生甲殼動物中的成功應(yīng)用得益于其顯微注射技術(shù)的成功建立，即基因編輯元件在甲殼動物中的遞送方式主要是通過顯微注射，遞送形式包括DNA質(zhì)粒、RNA和RNP三種。但是，顯微注射的方式和方法以及孵育的介質(zhì)因甲殼動物種類的不同而有所不同(見表1)。詳情如下。

表1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在水生甲殼動物中的應(yīng)用總結(jié)

續(xù)表1

3.1 水蚤(Water flea)

水蚤是淡水生境中的小型浮游甲殼動物。由于它們在水生食物鏈中占有重要地位，具有高度的表型可塑性，繁殖能力強(qiáng)，個體小，易于觀察，一直被用作基礎(chǔ)生物學(xué)、進(jìn)化和生態(tài)學(xué)研究的動物模型[40]。另外，水蚤在通常情況下是營單性生殖的，只有當(dāng)其處于不利的環(huán)境條件下才會營有性生殖[41]。因此，水蚤也是研究生殖方式轉(zhuǎn)換機(jī)制的難得的實驗動物模型。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于兩種水蚤：大型蚤和蚤狀溞。

3.1.1 大型蚤(D.magna) 大型蚤無眼基因(ey)基因與哺乳動物pax6基因同源，一般認(rèn)為其在眼部的發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。Nakanishi等[6]首次將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于大型蚤ey基因的敲除，將Cas9 mRNA和 sgRNA顯微注射到大型蚤的單細(xì)胞期胚胎中，成功誘導(dǎo)了無眼基因(ey)的突變。發(fā)現(xiàn)18%～47%的幼體的眼睛發(fā)育畸形，但是可發(fā)育成熟并產(chǎn)卵，其子一代中約有8%的個體仍然出現(xiàn)了眼睛畸形的表型，表明ey基因的突變表型可傳遞給子代。2017年Kumagai等[8]又采用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯了大型蚤ey基因的第10個外顯子，基因編輯元件的遞送形式采用RNP形式，即將Cas9蛋白與ey-sgRNA孵育后，注射到大型蚤的單細(xì)胞期胚胎中，成功導(dǎo)致靶基因的突變，觀察到了眼畸形的表型，獲得的體細(xì)胞誘變率和可遺傳誘變率分別高達(dá)96%和40%。另外，作者還成功實現(xiàn)了熒光報告基因的靶向敲入，在幼體中觀察到了熒光信號，而成體中只有生殖腺中可觀察到熒光信號表達(dá)。

5-羥色氨是一種吲哚衍生物，最早是從血清中發(fā)現(xiàn)的，又名血清素，廣泛存在于哺乳動物組織中，特別是在大腦皮層和神經(jīng)突觸內(nèi)的含量很高。在昆蟲中，5-羥色氨具有調(diào)控蛻皮激素和保幼激素分泌的作用，從而調(diào)控昆蟲卵子的發(fā)生和卵黃的合成。在十足目甲殼動物中，5-羥色氨還具有促進(jìn)生長激素的分泌、調(diào)控動物的行為和代謝的作用[42-43]。而色氨酸羥化酶(Tryptophan hydroxylase, TRH)則是5-羥色氨合成反應(yīng)的限速酶。為了解甲殼動物中5-羥色氨的功能，Rivetti等[44]采用CRISPR/Cas9技術(shù)在大型蚤中成功制備了7個TRH基因的缺失突變株，并分析了這些突變株中5-羥色氨在調(diào)節(jié)大型蚤生長、繁殖和行為上的作用。結(jié)果表明，TRH是5-羥色氨生物合成中的關(guān)鍵酶，TRH基因的突變可導(dǎo)致5-羥色氨的合成降低，而5-羥色氨的缺乏不僅降低了大型蚤的生長速度及其子代的大小，還影響了其對光的敏感性。

在節(jié)肢動物的生長發(fā)育過程中，蛻皮激素在調(diào)節(jié)其胚胎發(fā)育和生長繁殖中起著非常重要的作用。Adhitama等[45]利用CRISPR/Cas9技術(shù)將蛻皮激素誘導(dǎo)性表達(dá)的mCherry報告基因 (Ecdysone response element (EcRE)-controlled mCherry，EcRE-mCherry) 敲入大型蚤的基因組中，構(gòu)建了轉(zhuǎn)EcRE-mCherry基因大型蚤，從而可以實時了解大型蚤早期胚胎發(fā)育過程中蛻皮激素的時空表達(dá)譜，同時這種轉(zhuǎn)基因水蚤還可以成為監(jiān)測水環(huán)境中蛻皮激素活性的指示生物。

動物的性別決定機(jī)制與其轉(zhuǎn)錄因子Doublesex (Dsx)的上游調(diào)控通路的差異有關(guān)。而大型蚤的環(huán)境性別決定則是通過Dsx的同源基因Dsx1在雄性個體中的特異性表達(dá)來實現(xiàn)的。Ishak等[46]利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除了雄性胚胎Dsx1基因啟動子中的轉(zhuǎn)錄因子Vrille結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)Dsx1基因的表達(dá)顯著下降；在雌性胚胎中過表達(dá)Vrille基因，則上調(diào)Dsx1基因的表達(dá)，并誘導(dǎo)雌性胚胎產(chǎn)生了雄性特征。這表明，轉(zhuǎn)錄因子Vrille負(fù)責(zé)激活雄性胚胎中Dsx1基因的表達(dá)，促進(jìn)和維持雄性形狀，但是在雌性胚胎中該轉(zhuǎn)錄因子則被失活。

研究發(fā)現(xiàn)，以RNA形式，即Cas9 mRNA和 gRNA[6,44]，或RNP形式，即Cas9蛋白和gRNA結(jié)合[8]，顯微注射到大型蚤的單細(xì)胞胚胎中都可以取得較好的基因編輯效果。顯微注射需要選擇2～3周大的大型蚤排卵后的1 h之內(nèi)進(jìn)行，注射體積要控制在0.2 nL之內(nèi)，收集后的單細(xì)胞期胚胎暫存于冰浴的含80 mmol/L蔗糖的M4培養(yǎng)基(M4-蔗糖)中，每一個注射后的胚胎需要轉(zhuǎn)移到96孔板的單個孔內(nèi)，每孔添加100 mL含80 mmol/L蔗糖的M4培養(yǎng)基，23 ℃孵化3 d[6,47]。

3.1.2 蚤狀溞(D.pulex)，又稱淡水枝角水蚤 在脊椎和無脊椎動物中，Distal-less基因(Dll)編碼遠(yuǎn)端附肢發(fā)育所必須的轉(zhuǎn)錄因子的同源結(jié)構(gòu)域。Hiruta等[48]通過顯微注射Cas9 RNP，在淡水枝角水蚤中建立了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，設(shè)計了針對Dll基因的dll-sgRNA，并將Cas9/dll-sgRNA 核糖核蛋白復(fù)合物注射到單細(xì)胞期胚胎中，發(fā)現(xiàn)注射后胚胎的第二觸角和附肢的發(fā)育均異常。由于在Dll靶位點檢測到了缺失突變，可見基因敲除是成功的，實驗中觀察到的觸角和附肢的發(fā)育異常與dll基因的敲除有關(guān)。其中，第二觸角和附肢的發(fā)育有嚴(yán)重缺陷的突變體不能順利蛻皮，在成體前死亡，而有輕度或無表型缺陷的突變體是可存活的，并且可育的。

在淡水枝角水蚤的顯微注射條件方面，也可以通過顯微注射Cas9/sgRNA SNP到單細(xì)胞胚胎中來實現(xiàn)基因編輯，所需胚胎也是來源于至少2周大的淡水枝角水蚤，在其排卵后1 h之內(nèi)收集，但是，收集后的單細(xì)胞期胚胎要暫存于冰浴的含60 mmol/L蔗糖的M4培養(yǎng)基(M4-蔗糖)中。注射完成后，轉(zhuǎn)移到含2%瓊脂和M4-蔗糖的6孔培養(yǎng)板中，18 ℃孵化[48]。

3.2夏威夷明鉤蝦(P. hawaiensis)

夏威夷明鉤蝦是生活于淺水區(qū)的海洋片腳類甲殼動物，以碎屑為食。在26 ℃下的胚胎發(fā)育大約需要10 d，生命周期為7～8周[49]。其身體結(jié)構(gòu)是片腳類的典型代表。由于夏威夷明鉤蝦全年都可以繁殖，且擁有典型的身體結(jié)構(gòu)，使其成為重要的新興模式生物[50]。

在兩側(cè)對稱動物中，Hox基因?qū)τ诰S持身體的前后和左右對稱至關(guān)重要。Serano等[51]對夏威夷明鉤蝦的Hox基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)和基因組結(jié)構(gòu)分析，并通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，靶向敲入了eGFP基因，示蹤了觸角足突變基因(Antennapedia,Antp)的組織表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)該基因僅表達(dá)于前胸部，為解析Hox基因在節(jié)肢動物發(fā)育和進(jìn)化中的作用奠定了基礎(chǔ)。

Martin等[7]將CRISPR/Cas9靶向誘變技術(shù)和RNAi敲除技術(shù)聯(lián)用，在夏威夷明鉤蝦中解析了6個Hox基因：Ubx、abd-A、Abd-B、Antp、Scr和Dfd的功能。發(fā)現(xiàn)基因Ubx的表達(dá)可抑制顎部的發(fā)育，但促進(jìn)鰓的發(fā)育；基因Abd-A和Abd-B是身體后部附肢的正確發(fā)育所必需的；基因Antp決定了爪的形態(tài)；基因Scr和Antp與顎肢的發(fā)育有關(guān)；基因Dfd與觸角的發(fā)育有關(guān)?？傊?，上述研究結(jié)果很好地揭示了不同Hox基因的時空表達(dá)是如何調(diào)控附肢的發(fā)育的。

在夏威夷明鉤蝦的顯微注射條件方面，基因編輯元件可以RNA 形式，也可以RNP形式，通過顯微注射遞送至胚胎中，實現(xiàn)對靶基因的定向編輯。其中，Martin等[7]是以1∶2的摩爾比將Cas9 mRNA和sgRNA混合，注射體積約為40～60 pL，注射劑量為400～600 ng/μL RNP。而Serano等[51]則是將333 ng/μL Cas9蛋白與200 ng/μL sgRNA的劑量注射于胚胎中。注射用的單細(xì)胞期胚胎需要在前一天晚上收集，并置于過濾消毒海水中，于18 ℃條件下培養(yǎng)。后來，F(xiàn)arboud等[28]又進(jìn)一步改進(jìn)了顯微注射的條件，即在2 μmol/L Cas9蛋白與4～8 μmol/L sgRNA的RNP復(fù)合物中添加0.05%酚紅，室溫孵育10 min后，再顯微注射到胚胎中，然后將注射后胚胎轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，置于密封良好的塑料器皿中，內(nèi)襯濕紙巾以保持濕度，置于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置12 h/12 h的明暗周期。

3.3 脊尾白蝦(E. carinicauda)

脊尾白蝦為十足目甲殼動物，生活于咸淡水中，生長發(fā)育速度快，繁殖周期短，是很好的甲殼動物實驗?zāi)Ｐ汀＝陙?，隨著人工繁育技術(shù)的日漸成熟，脊尾白蝦也發(fā)展成為中國一種重要水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種[52]。近幾年，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也已在脊尾白蝦中得到成功應(yīng)用。

節(jié)肢動物的外骨骼是由幾丁質(zhì)和硬化蛋白構(gòu)成的剛性支架。為了生長和發(fā)育，節(jié)肢動物已經(jīng)發(fā)展出一種蛻皮機(jī)制來定期替換它們舊的外骨骼[53]。在蛻皮過程中，幾丁質(zhì)酶在降解舊角質(zhì)層的過程中起主導(dǎo)作用[54-56]。Gui等[57]克隆了脊尾白蝦的幾丁質(zhì)酶4(Chitinase 4)(EcChi4)，并采用CRISPR/Cas9技術(shù)成功敲除了脊尾白蝦的EcChi4基因，并發(fā)現(xiàn)這種突變可以遺傳給下一代。基因編輯元件的遞送形式為RNA，即Cas9 mRNA和EcChi4-gRNA。作者針對脊尾白對蝦的發(fā)育特點所建立的顯微注射方法，為CRISPR/Cas9技術(shù)在脊尾白蝦中的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。隨后，Sun等[58]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦的EcChi4基因主要表達(dá)于肝胰腺，且在感染副溶血性弧菌或嗜水氣單胞菌后會上調(diào)表達(dá)。于是作者利用CRISPR/Cas9技術(shù)將EcChi4基因敲除，發(fā)現(xiàn)當(dāng)脊尾白蝦受到副溶血性弧菌或嗜水弧菌的攻擊時，EcChi4基因敲除組的死亡率明顯高于野生型脊尾白蝦，表明EcChi4基因參與了脊尾白蝦的免疫防御作用。由于無脊椎動物在免疫防御過程中會大量釋放活性氧，以阻止外來病原微生物的入侵，但活性氧在體內(nèi)的大量累積會造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而類胡蘿卜素可以作為氧自由基清除劑對機(jī)體起到保護(hù)作用。類胡蘿卜素異構(gòu)加氧酶(Carotenoid isomerooxygenase，EcNinaB-X1)是一種類胡蘿卜素加氧酶，具有降解類胡蘿卜素的作用。 Sun等[59]采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了脊尾白蝦EcNinaB-X1基因，發(fā)現(xiàn)該突變體在受到副溶血性弧菌或嗜水弧菌的攻擊時存活率明顯高于野生型。同年，Sun等[60]又敲除了脊尾白蝦另一個類胡蘿卜素加氧酶基因：β, β-胡蘿卜素 9’, 10’-加氧酶(EcBCO2)，得到的突變體的肝胰腺呈現(xiàn)更深的橙色，并且具有更高的抗病性。因此，該基因可以作為對蝦分子標(biāo)記輔助育種的候選基因，用于培育抗病抗逆對蝦。

在甲殼動物中，蛻皮抑制激素(Molt-inhibiting hormone, MIH)是一種重要的負(fù)調(diào)控因子，在抑制蛻皮過程中起著關(guān)鍵作用。Zhang等[61]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了脊尾白蝦EcMIH基因，并分析了基因敲除脊尾白蝦的表型變化。從注射的250個胚胎中，共篩選出12個敲除蝦(EcMIH-KO)，突變率高達(dá)4.8%。發(fā)現(xiàn)EcMIH-KO蝦的體長明顯增加，幼蟲的變態(tài)時間明顯縮短，而且EcMIH-KO蝦未出現(xiàn)死亡和畸形等問題，為對蝦的分子遺傳育種奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

在脊尾白蝦的顯微注射條件方面，基因編輯元件的遞送均是采用RNA形式，注射到單細(xì)胞期胚胎中。其中，收集的單細(xì)胞胚胎首先暫存于4 ℃無菌海水中，然后以200 ng/μL Cas9 mRNA和100 ng/μL sgRNA 的劑量注射，注射后胚胎馬上轉(zhuǎn)移到含有滅菌海水的培養(yǎng)皿中，室溫下于100 r/min的速度于搖床上培養(yǎng)。15 d后，脊尾白蝦即可孵化出來[57-61]。

4 結(jié)語和展望

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)因其簡單、快速和成本低的特點，自建立以來就廣受歡迎，很快被應(yīng)用到各種動物、植物及其體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因編輯研究中，成為人們探究基因功能、修復(fù)受損基因、沉默有害基因以及改良經(jīng)濟(jì)物種種質(zhì)性狀的重要工具，大大推動了生物學(xué)領(lǐng)域的研究與發(fā)展。目前，該技術(shù)僅在少數(shù)幾種水生甲殼動物包括兩種水蚤(大型蚤和蚤狀溞)、夏威夷明鉤蝦和脊尾白蝦中得到了很好的應(yīng)用。但是，幾種重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蝦類如刀額新對蝦(Metapenaeusensis，俗稱基圍蝦)、南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)、日本囊對蝦(Penaeusjaponicus)和中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)中卻未見任何相關(guān)報道。造成這一困局的主要原因是顯微注射技術(shù)在應(yīng)用上的局限性。不難看出，水蚤、夏威夷明鉤蝦和脊尾白蝦均是抱卵，其早期胚胎能夠耐受顯微注射操作，也就是說，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在上述4種小型甲殼動物中的成功完全得益于顯微注射技術(shù)的建立。而上述幾種對蝦產(chǎn)卵后，均不抱卵，其受精卵為均黃卵，針刺后極易破裂，導(dǎo)致顯微注射后胚胎的孵化率很低，又由于對蝦受精卵的卵裂速度快，40～55 min即完成第一次卵裂，限制了可注射胚胎的數(shù)量，進(jìn)而導(dǎo)致對蝦的基因編輯效率低下。因此，亟需開發(fā)其它溫和的遞送方式，例如對蝦病毒介導(dǎo)的基因遞送工具以及納米遞送載體等，以解決目前對蝦基因編輯效率低下，難以廣泛開展的問題。

蟹也是中國一種重要的人工養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種，如淡水生活的中華絨螯蟹、海水生活的三疣梭子蟹和擬穴青蟹，其生長發(fā)育和抗逆抗病相關(guān)基因的功能研究也日益得到人們的關(guān)注。但是，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在蟹類中的應(yīng)用尚未見任何成功報道。在蟹類中缺乏有效的基因編輯元件(Cas9和sgRNA)遞送方法或遞送工具，可能也是限制CRISPR/Cas9技術(shù)在蟹類中應(yīng)用的主要原因，因為這是在非模式動物中開展基因編輯工作的前提條件和亟待解決的瓶頸問題。

隨著越來越多的水生甲殼動物如南美白對蝦[1]的全基因組測序結(jié)果的公布，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于甲殼動物中的條件將日趨成熟。因此，發(fā)展高效的甲殼動物基因遞送工具是勢在必行的，一旦突破，必將推動甲殼動物在生態(tài)、遺傳、發(fā)育和進(jìn)化等各方面研究的飛速發(fā)展。當(dāng)然，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)仍然存在脫靶問題，但隨著哺乳動物中CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展和日臻完善，將大大促進(jìn)其在甲殼生物基因功能研究中的的應(yīng)用。