徐金環(huán)，尹琎，李琳，李赟，張義成

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院，武漢430030

血管內皮細胞是移植排斥過程中最先接觸到反應性T淋巴細胞的異體細胞，而T淋巴細胞識別異型抗原對其后的異基因反應有至關重要的作用[1]。研究報道，將T淋巴細胞暴露于血管內皮細胞可導致T淋巴細胞無反應性[2]。在急性移植物抗宿主病(aGVHD)的發(fā)病過程中，Th1細胞通過干擾素-γ(IFN-γ)啟動異體免疫反應后的炎癥反應，且IFN-γ又可通過不同的途徑來誘導免疫耐受及減輕異體免疫反應[3]。除公認的抑制性DC細胞外，血管內皮細胞可能在IFN-γ誘導的免疫耐受過程中也發(fā)揮重要作用，但目前相關研究較少。吲哚胺-2，3-加氧酶(IDO)是免疫反應中的一種重要調控酶，表達IDO的細胞能抑制T淋巴細胞反應和促進耐受形成[4]。研究表明，心臟移植大鼠移植心臟小血管IDO表達量及表達細胞數(shù)與移植物獲得耐受的時間均呈正相關關系，且在aGVHD小鼠靶器官的血管內皮細胞可檢測到IDO表達[5,6]。2017年1月～2018年12月，本研究將IFN-γ作用后的小鼠肺微血管內皮細胞(PMVECs)與T淋巴細胞共培養(yǎng)，觀察其對T淋巴細胞增殖的影響，并探討其機制是否與IDO有關?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：健康8～10周齡雌性Balb/C小鼠16只，體質量18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，小鼠IFN-γ和小鼠淋巴細胞分離液購自深圳達科為生物技術有限公司，蛋白Marker購自立陶宛Fermentas公司，Kyn和Trp標準品購自美國Sigma公司，BCA法蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。主要儀器：0.4 μm孔徑6孔Transwell板購自美國Corning公司，高效液相色譜儀、1525二元泵、2487紫外檢測器、2475-熒光檢測器、717自動進樣器和色譜柱Atlantic C18 4.6 mm×150 mm購自美國Waters公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購自英國Syngene公司。

1.2 小鼠PMVECs分離、培養(yǎng)及鑒定

1.2.1 小鼠PMVECs分離、培養(yǎng) 選擇健康Balb/C小鼠10只，斷髓處死后，浸泡于75%乙醇中5 min；用組織剪逐層剪開胸腔，切下肺組織，剪去表面的臟層胸膜，剪取胸膜下肺組織(厚度不超過1.5 mm)。將肺組織用鋒利的手術刀切成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，用彎頭滴管吸取組織塊接種到50 cm3培養(yǎng)瓶壁上，3～4塊/cm2。種植壁用少量RPMI 1640培養(yǎng)液(含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)預濕，以利于組織塊貼壁。將植塊后的培養(yǎng)瓶倒置，加入5 mL左右培養(yǎng)液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。組織塊貼壁4 h后，輕輕翻正培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)；6～8 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞遷出情況。植塊后最先游出的是血細胞，翻正瓶后約24 h可見到明顯的內皮細胞游出；約36 h后更換培養(yǎng)液，約60 h后輕輕吸掉組織塊，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。以后每兩天換半液1次。待細胞融合90%以上時，加入適量胰酶消化細胞，以1∶3的比例進行傳代，取第2～5代細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 小鼠PMVECs鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學觀察 ①倒置顯微鏡觀察：在細胞培養(yǎng)的第7～10天，將孔板置于倒置顯微鏡下，分別用100、200倍倒置顯微鏡進行觀察。結果顯示，小鼠肺組織植塊24 h后，可見少量PMVECs爬出，60 h后大量PMVECs爬出；原代培養(yǎng)后10 d，細胞融合成單層，呈典型的“鵝卵石”、“鋪路石”樣排列，形態(tài)為多邊形、短梭形，邊界清楚，細胞質豐富，細胞核為圓形或橢圓形(圖1)。②透射電鏡觀察：取生長狀態(tài)良好的第3代PMVECs，制成密度為1×105/mL的細胞懸液，1 200 r/min離心5 min，去上清；2%戊二醛固定液(pH為7.2～7.4)固定，4 ℃條件下保存，透射電鏡下觀察細胞結構。結果顯示，PMVECs形態(tài)均一，細胞質表面有許多突起形成細絨毛，細胞質中有空泡；細胞器豐富，如線粒體、高爾基復合體、粗面內質網(wǎng)、溶酶體等，細胞質內可見Weibel-Pallade小體(圖2)。

圖1 倒置顯微鏡下觀察PMVECs形態(tài)

注：箭頭指示為Weibel-Pallade小體。

1.2.2.2 細胞表面抗原檢測 采用間接免疫熒光法。將適量第3代PMVECs懸液滴到玻片上，待細胞貼壁融合50%左右，4%多聚甲醛固定25 min；PBS清洗3次，0.3% TritonX-100破膜10 min；PBS清洗，5% BSA封閉，37 ℃條件下孵育30 min。加入抗CD31大鼠抗小鼠抗體(稀釋比例為1∶100，用PBS代替一抗作為對照)，4 ℃條件下孵育過夜；PBS清洗3次，加入PE標記的羊抗大鼠熒光二抗，室溫條件下孵育2 h；PBS清洗3次，使用10 nmol的DAPI常溫復染3 min；PBS清洗3次，置于熒光顯微鏡下觀察細胞表面熒光情況。結果顯示，分離培養(yǎng)的PMVECs純度>95%，細胞均表達內皮細胞表面標志CD31(PMVECs呈明亮的紅色熒光，DAPI復染細胞核呈藍色)。

1.3 不同濃度IFN-γ作用后的PMVECs對共培養(yǎng)T淋巴細胞增殖能力影響的觀察

1.3.1 T淋巴細胞分離 將6只Balb/C小鼠斷髓處死，無菌分離頸部、雙側腋窩、腹股溝淺、腸系膜淋巴結，去掉被膜；于200目尼龍網(wǎng)過濾，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，1 500 r/min離心5 min。將CSFE(終濃度為4.5 μmol/L)加入含2% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，用配置好的培養(yǎng)液進行重懸，調整細胞密度為1×107/mL；37 ℃條件下孵育15 min，每隔5 min混勻1次；加入等體積的FBS終止5 min，1 000 r/min離心5 min，含2% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌2次，1 000 r/min離心5 min，收集下層沉淀細胞即為T淋巴細胞。

1.3.2 分組處理及T淋巴細胞增殖能力觀察 采用流式細胞術。以2×105/孔將第3代PMVECs種植至Transwell板下層小室，隨機分為空白對照組、10 ng/mL組、20 ng/mL組、50 ng/mL組、80 ng/mL組，分別在Transwell板中加入不同濃度IFN-γ，調整其終濃度分別為0、10、20、50、80 ng/mL，每組設置3個復孔。24 h后PMVECs鋪滿Transwell板底，棄上清，每孔用RPMI 1640洗兩遍，棄上清。在Transwell板每孔上層小室中加入2×106個已染CFSE的T淋巴細胞，每孔總培養(yǎng)體系為2.5 mL，置于37 ℃、5% CO2孵箱中，培養(yǎng)72 h。收集Transwell板上層小室中的T淋巴細胞，PBS洗3次，10 g/L多聚甲醛PBS固定20 min。使用流式細胞儀檢測淋巴細胞增殖情況，CellQuest軟件分析結果并計算淋巴細胞增殖指數(shù)。

1.4 IFN-γ對PMVECs培養(yǎng)液上清色氨酸、犬尿氨酸水平及細胞IDO表達影響的觀察

1.4.1 細胞分組處理 取生長狀態(tài)良好的第3代PMVECs，以1×106/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板，隨機分為觀察組和對照組，觀察組加入終濃度為80 ng/mL的IFN-γ，對照組加入等量PBS。

1.4.2 細胞培養(yǎng)上清中色氨酸、犬尿氨酸水平及IDO活性檢測 采用反相高效液相色譜法。兩組培養(yǎng)24 h，收集細胞培養(yǎng)液上清。取300 μL細胞培養(yǎng)上清，加入等體積5%高氯酸，在漩渦振蕩器上充分混勻后，冰上放置10 min；4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，收集上清液500 μL，吸取上清20 μL進樣。在C18反相柱上分離，流動相是含有27 mL/L乙腈的15 mmol 乙酸-乙酸鈉(pH為3.6)，在287 nm激發(fā)波長和357 nm發(fā)射波長下，采用熒光檢測器檢測色氨酸、紫外分光光度計檢測犬尿氨酸在360 nm處具有最大吸收峰。因培養(yǎng)上清使用了等體積5%高氯酸沉淀蛋白，實際犬尿氨酸、色氨酸被對倍稀釋，所以培養(yǎng)液中實際犬尿氨酸和色氨酸水平是測量結果的兩倍。IDO活性=犬尿氨酸水平/色氨酸水平。

1.4.3 細胞IDO mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。兩組培養(yǎng)24 h，使用TRIzol試劑分離總RNA，轉錄試劑盒將總RNA(2 μg)反轉錄為cDNA。IDO上游引物5′-CACTGAGCACGGACGGACTGAGA-3′、下游引物5′-TCCAATGCTTTCAGGTCTTGACGC-3′，GAPDH上游引物5′-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3′、下游引物5′-TGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。PCR反應體系：95 ℃、5 min；94 ℃、30 s，59 ℃、30 s，72 ℃、45 s，72 ℃、10 min，共35個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物在2%溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠上，ChemiImager 4400系統(tǒng)上可視化條帶。以Image J軟件分析條帶灰度值，以IDO與GAPDH條帶灰度值的比值計算IDO mRNA相對表達量。

1.4.4 細胞IDO蛋白表達檢測 采用Western blotting法。兩組培養(yǎng)24 h，加入組織裂解液提取蛋白并進行蛋白定量。取10 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉印后，用5%脫脂奶粉封閉；加入兔抗小鼠IDO及β-actin一抗(稀釋比例分別為1∶300、1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；TBST室溫洗滌3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗(稀釋比例為1∶2 000)，室溫孵育45 min。使用凝膠成像分析儀分析條帶灰度值，以IDO與β-actin條帶灰度值的比值計算IDO蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組T淋巴細胞增殖指數(shù)比較 空白對照組、10 ng/mL組、20 ng/mL組、50 ng/mL組、80 ng/mL組T淋巴細胞增殖指數(shù)分別為3.06±0.07、2.93±0.09、2.46±0.28、2.21±0.41、2.20±0.05，20 ng/mL組、50 ng/mL組、80 ng/mL組T淋巴細胞增殖指數(shù)均低于空白對照組(P均<0.01)，20 ng/mL組、50 ng/mL組、80 ng/mL組T淋巴細胞增殖指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。

2.2 觀察組和對照組細胞培養(yǎng)上清中色氨酸、犬尿氨酸水平及IDO活性比較 觀察組細胞培養(yǎng)上清中色氨酸水平低于對照組，犬尿氨酸水平及IDO活性均高于對照組(P均<0.01)。見表1。

表1 觀察組和對照組細胞培養(yǎng)上清中色氨酸、犬尿氨酸水平及IDO活性比較

2.3 觀察組和對照組細胞IDO mRNA及蛋白表達比較 觀察組和對照組細胞IDO mRNA相對表達量分別為0.68±0.02、0，IDO蛋白相對表達量分別為0.49±0.02、0；兩組比較P均<0.01。

3 討論

血管內皮細胞不僅可以使其與內皮下基質成分隔離，還可參與機體的炎癥反應和免疫應答過程[2]。在異基因造血干細胞移植過程中，植入的活性淋巴細胞最先接觸的是血管內皮細胞；一方面，血管內皮細胞作為非專職抗原呈遞細胞，可發(fā)揮呈遞抗原作用；另一方面，血管內皮細胞可參與機體的天然免疫調節(jié)過程。體外研究顯示，IFN-γ可誘導人血管內皮細胞通過表達IDO而發(fā)揮抑制淋巴細胞增殖和病毒復制的作用[7～9]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染時，IFN-γ能刺激腦微血管內皮細胞表達和IDO活化，從而發(fā)揮抗感染效應[10]。本研究通過組織塊貼壁法培養(yǎng)小鼠PMVECs，并采用免疫熒光法及透射電鏡進行鑒定，結果顯示第3代PMVECs純度可達95%以上，說明分離培養(yǎng)的PMVECs有較高純度，適合后期實驗。

IFN-γ可誘導血管內皮細胞的MHCⅡ類分子基因轉錄及蛋白合成，MHCⅡ類分子是抗原提呈細胞發(fā)揮抗原呈遞作用的關鍵性效應分子，其表達使血管內皮細胞具備了作為抗原提呈細胞的潛能。血管內皮細胞以MHCⅡ類分子限制性方式將抗原肽呈遞給淋巴細胞，并可通B7/CD28、CD40/CD40L CD58(LFA-3)/CD2(LFA-2)等途徑向淋巴細胞提供共刺激信號，激活CD4+T淋巴細胞釋放共同刺激信號，導致細胞毒性T淋巴細胞激活，從而促進免疫應答的進程[2,3]。血管內皮細胞表面均有MHCⅠ類分子，許多血管內皮細胞也持續(xù)表達MHCⅡ類分子，其中微血管和靜脈血管內皮細胞更為顯著，但大血管內皮細胞上無MHCⅡ類分子。為了避免PMVECs與T淋巴細胞接觸后的相互作用，本研究采用Transwell板進行間接共培養(yǎng)。結果顯示，20 ng/mL組、50 ng/mL組、80 ng/mL組T淋巴細胞增殖指數(shù)均低于空白對照組，說明IFN-γ作用后的PMVECs可抑制與其共培養(yǎng)的T淋巴細胞增殖；雖然20 ng/mL組、50 ng/mL組、80 ng/mL組T淋巴細胞增殖指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學差異，但80 ng/mL組T淋巴細胞增殖指數(shù)最低，因此選擇該濃度進行后續(xù)實驗。

IDO是一種含血紅素酶，可催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝的起始和限速步驟。在炎癥反應中，炎癥因子可以誘導IDO表達， 而IFN-γ是促進IDO表達的最強誘導劑[4]。色氨酸的缺乏和(或)其代謝產(chǎn)物的過度表達具有免疫調節(jié)作用，其可通過增加細胞凋亡敏感性和抑制T淋巴細胞活化而抑制附近的T淋巴細胞反應[4]。唐曉瓊等[11]研究報道，IFN-γ可體外誘導骨髓間充質干細胞表達IDO，且IDO基因和蛋白表達均與IFN-γ濃度呈正相關關系。Liang等[12]研究報道，IFN-γ可刺激HUVEC誘導IDO表達，且具有時間和劑量依賴性。本研究結果顯示，正常情況下PMVECs不表達IDO，而IFN-γ作用后可檢測到IDO mRNA及蛋白表達；反相高效液相色譜法檢測結果顯示，80 ng/mL的IFN-γ誘導后，PMVECs細胞培養(yǎng)上清中色氨酸水平極低，而犬尿氨酸水平增加明顯，提示色氨酸幾乎完全代謝；表明IFN-γ能誘導PMVECs表達IDO，導致色氨酸消耗及其代謝產(chǎn)物的積累，即“色氨酸饑餓”及“色氨酸代謝產(chǎn)物累積”兩種條件同時存在、相互促進，共同對T淋巴細胞產(chǎn)生增殖抑制作用[14,15]。

綜上所述，IFN-γ作用后的PMVECs可對共培養(yǎng)的T淋巴細胞產(chǎn)生增殖抑制作用，其機制可能與促進色氨酸降解、犬尿氨酸累積及IDO表達有關。異基因造血干細胞輸入后最先接觸到血管內皮細胞，而且機體血管內皮細胞分布廣泛，其數(shù)目遠多于其他抗原呈遞細胞；提示我們可通過保護血管內皮細胞，調節(jié)IFN-γ/血管內皮細胞途徑來調控機體的免疫調節(jié)功能，從而達到誘導aGVHD免疫耐受的作用。