李博園,韓 敏，張明英，陳 瑩

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.西安怡康醫(yī)藥連鎖有限公司，陜西 西安 710000)

中藥白芷為傘形科(Umbelliferae)植物[Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm. )Benth. et Hook. f. ]或杭白芷[Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm. )Benth. et Hook. f. var.formosana(Boiss. )Shan et Yuan]的干燥根，具祛風(fēng)濕，活血排膿，生肌止痛等功效，是一味傳統(tǒng)中藥[1～2]。白芷藥用化學(xué)成分主要有香豆素類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)以及黃酮類(lèi)，其中香豆素類(lèi)中的歐前胡素及異歐前胡素是白芷質(zhì)量的主要控制成分，具有鎮(zhèn)痛、解痙等作用[3～5]。目前對(duì)中藥白芷的研究多集中在藥理和化學(xué)成分[6～8]等方面，景汝勤等人研究了白芷根的組織分化[9]，但對(duì)其結(jié)構(gòu)發(fā)育與藥用成分積累關(guān)系研究較少[10]。歐前胡素在紫外波長(zhǎng)下呈藍(lán)色熒光，具有易溶于乙醇的性質(zhì)[11]。因此，本研究以杭白芷根為研究對(duì)象，通過(guò)顯微鏡技術(shù)觀察根的解剖結(jié)構(gòu)，結(jié)合組織化學(xué)定位法以及植物化學(xué)方法，研究根中香豆素類(lèi)藥用成分的分布以及含量變化，旨在為進(jìn)一步揭示杭白芷根的結(jié)構(gòu)與藥用成分的積累關(guān)系，為評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

杭白芷主根于2018年3-10月采自陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園栽培植株。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片法 選擇不同時(shí)期生長(zhǎng)正常健康的植株，將主根分割成0.5～1 cm長(zhǎng)的小段，50%～70%乙醇FAA固定液固定一周、再進(jìn)行脫水、包埋，之后切片，切片厚度8 ～10 μm，番紅-固綠復(fù)合染色，中性樹(shù)膠封藏，LEICA ICC50 W型顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 組織化學(xué)定位法 取新鮮杭白芷主根中部，切成0.3～5 cm數(shù)個(gè)小段。取其中1小段冰凍切片，厚度30 μm，稀甘油封片后置于Leica DMBL熒光顯微鏡下，紫外光激發(fā)，觀察并拍照。陰性對(duì)照:取1小段，置于70%乙醇FAA固定液中一周，再依次經(jīng)過(guò)85%、95%、100%乙醇處理后，進(jìn)行冰凍切片，切片厚度30 μm，于Leica DMBL熒光顯微鏡下觀察并拍照。陽(yáng)性對(duì)照：取歐前胡素為陽(yáng)性對(duì)照，配制歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將其滴加在載玻片上，制作臨時(shí)裝片，于Leica DMBL熒光顯微鏡下觀察并拍照。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 分別測(cè)量不同月份的杭白芷主根直徑，統(tǒng)一測(cè)量位置為全長(zhǎng)1/2處，再選取相對(duì)應(yīng)位置FAA固定，按照“1.2.1”石蠟切片法進(jìn)行切片染色，之后每個(gè)時(shí)期選取在同一倍數(shù)下的5個(gè)視野，進(jìn)行分泌道數(shù)量的統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 植物化學(xué)法 研究采用高效液相色譜法對(duì)杭白芷根中歐前胡素、異歐前胡素的含量進(jìn)行提取測(cè)定[12]。

1.2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)。色譜條件：XB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm,5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(65：35)；檢測(cè)波長(zhǎng)：247 nm，流速：1.0 mL·min，柱溫：30℃。

1.2.4.2 對(duì)照品溶液及供試品溶液的制備。精密稱(chēng)取歐前胡素1 mg，異歐前胡素0.6 mg，加流動(dòng)相溶解并制成濃度分別為1 μg·mL-1和6μg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液；取不同時(shí)期的杭白芷粉末(過(guò)3號(hào)篩)各1.000 g，精密稱(chēng)定后置錐形瓶中，再加流動(dòng)相40 mL，超聲30 min，靜置至室溫過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，加流動(dòng)相定容，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾作為供試品溶液備用。

1.2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn)及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取對(duì)照品溶液10 μL，進(jìn)樣5次，根據(jù)峰面積計(jì)算得歐前胡素、異歐前胡素的RSD分別為1.42%和1.05%，儀器精密度良好；取同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定歐前素及異歐前胡素的峰面積，表明歐前胡素與異歐前胡素在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定再根據(jù)測(cè)得的峰面積值計(jì)算RSD，RSD分別為1.37%和1.14%。

1.2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取對(duì)照品溶液，分別稀釋1、3、5、8、10倍，分次進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果歐前胡素在0.055 μg～0.555 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；異歐前胡素在0.033 μg～0.33 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.4.5 樣品含量測(cè)定。分別取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述高效液相色譜(HPLC)條件測(cè)得峰面積，并計(jì)算歐前胡素和異歐前胡素的含量。

1.2.4.6 重復(fù)性及加樣回收率實(shí)驗(yàn)。取9月份杭白芷，照“1.2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液5份，按上述色譜條件測(cè)定，歐前胡素、異歐前胡素的平均含量分別為0.097%和0.022%，RSD為0.89%，1.07%，表明該方法重現(xiàn)性良好；取9月份杭白芷粉末(過(guò)3號(hào)篩)約0.5 g，稱(chēng)定，分別加入已知濃度的對(duì)照品適量，照“1.2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，各取10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算歐前胡素的平均加樣回收率為99.4%，RSD為0.42%；異歐前胡素的平均加樣回收率為98.9%，RSD為0.89%。

2 結(jié)果

2.1 根的結(jié)構(gòu)發(fā)育特征

杭白芷根的次生結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)依次包括周皮、形成層、次生韌皮部、次生木質(zhì)部(圖版Ⅰ，1)。次生結(jié)構(gòu)開(kāi)始形成以后，中柱鞘細(xì)胞不斷分裂形成木栓形成層，木栓形成層進(jìn)一步分裂，向內(nèi)產(chǎn)生栓內(nèi)層細(xì)胞，向外產(chǎn)生木栓層細(xì)胞，木栓形成層細(xì)胞較小且排列緊密，栓內(nèi)層為排列較疏松單層薄壁細(xì)胞，木栓層細(xì)胞一般由5～8層，呈磚形、排列整齊的細(xì)胞構(gòu)成(圖版Ⅰ，2～3)。在木栓形成層形成早期，表皮細(xì)胞和初生皮層仍可見(jiàn)，之后隨著周皮的產(chǎn)生和次生維管組織的增加逐漸脫落，周皮由木栓層、木栓形成層和栓內(nèi)層細(xì)胞共同組成(圖版Ⅰ，4)。周皮內(nèi)側(cè)為皮層薄壁細(xì)胞，其細(xì)胞近圓形，排列較疏松，有細(xì)胞間隙，皮層內(nèi)可見(jiàn)體積較大的橢圓形分泌道分布，其次向內(nèi)是次生韌皮部(圖版Ⅰ，5)，最內(nèi)側(cè)為次生木質(zhì)部(圖版Ⅰ，6)。次生韌皮部由大量韌皮薄壁細(xì)胞和少量的篩管、伴胞組成，次生韌皮部中也可見(jiàn)數(shù)個(gè)類(lèi)橢圓形的分泌道大致呈輪傘狀分布，導(dǎo)管、木纖維、薄壁細(xì)胞、木射線等共同組成次生木質(zhì)部(圖版Ⅰ，7)，在次生木質(zhì)部中，有大量的木薄壁組織細(xì)胞(圖版Ⅰ，5～7)。維管射線由次生韌皮部橫向發(fā)育出韌皮射線和次生木質(zhì)部的木射線二者共同組成(圖版Ⅰ，8)。

2.2 組織化學(xué)定位

熒光顯微鏡下觀察杭白芷橫切面可以看出，在紫外光激發(fā)下，導(dǎo)管及周皮有熒光現(xiàn)象，香豆素類(lèi)的積累部位分泌道也有較明顯的熒光出現(xiàn)(圖版Ⅰ，9)，而其他部位無(wú)熒光出現(xiàn)，陰性對(duì)照除周皮和導(dǎo)管以外，其他部位無(wú)熒光，分泌道熒光消失(圖版Ⅰ，10)，歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品的陽(yáng)性對(duì)照中，歐前胡素發(fā)出的熒光與分泌道熒光一致(圖版Ⅰ，11)。

2.3 統(tǒng)計(jì)結(jié)果

對(duì)不同時(shí)期杭白芷主根及根中分泌道進(jìn)行觀察，并統(tǒng)計(jì)了主根直徑大小以及分泌道的數(shù)量。在表1中可以看出，整個(gè)發(fā)育過(guò)程中，根直徑大小以及分泌道數(shù)量隨著月份逐漸增長(zhǎng)，9-10月后增長(zhǎng)趨于平穩(wěn)。

表1 杭白芷根直徑大小以及分泌道數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 含量測(cè)定結(jié)果

以歐前胡素、異歐前胡素為評(píng)價(jià)指標(biāo)(圖1為對(duì)照品HPLC圖，圖2為樣品HPLC圖)，分別測(cè)得不同時(shí)期杭白芷根中藥用成分的含量。圖3為不同時(shí)期杭白芷根中歐前胡素含量積累的動(dòng)態(tài)過(guò)程，可以看出杭白芷根中的歐前胡素含量在3-5月份先緩慢增加后下降至全年最低為0.127%，而后在5-7月逐漸上升，7-8月又出現(xiàn)回落，在8-9月迅速上升，達(dá)到全年最高為0.692%，之后又出現(xiàn)下降；圖4為異歐前胡素含量積累的動(dòng)態(tài)過(guò)程，異歐前胡素含量總體相比歐前胡素較低，可以看出3-7月處于上升趨勢(shì)，7-8月出現(xiàn)下降，之后再逐漸增加；總含量為歐前胡素和異歐前胡素總和，在圖5總含量的動(dòng)態(tài)變化中可以看到，基本和歐前胡素變化趨勢(shì)一致，在9月份達(dá)到全年最高為0.781%。

3 討論

大多數(shù)傘形科植物中普遍存在分泌組織[13]。杭白芷根、莖以及葉中均有分泌道的存在[14～15]，本研究主要觀察了根的解剖結(jié)構(gòu)，次生結(jié)構(gòu)主要由周皮、皮層、次生韌皮部、次生木質(zhì)部所構(gòu)成，在中柱鞘和次生韌皮部中可見(jiàn)分泌道分布其中[10]，中柱鞘薄壁組織中的分泌道體積較大，次生韌皮部中的分泌道較小，大致呈輪傘狀分布，在北柴胡和狹葉柴胡中也有類(lèi)似的現(xiàn)象[16～17]。在對(duì)不同時(shí)期根直徑大小以及分泌道數(shù)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果中可以看出，隨著根直徑的增長(zhǎng)，分泌道數(shù)量也逐漸增加，當(dāng)根直徑大小趨于穩(wěn)定，分泌道數(shù)量也趨于穩(wěn)定，結(jié)合組織化學(xué)定位結(jié)果，表明分泌道是香豆素類(lèi)藥用成分積累的主要部位，這與蘭志瓊等在白芷根中香豆素類(lèi)成分的組織化學(xué)定位研究中表明，香豆素類(lèi)成分主要分布于分泌組織內(nèi)，結(jié)果基本一致[18～19]，因此分泌道的分布和數(shù)量可以作為評(píng)價(jià)杭白芷根中藥用成分香豆素類(lèi)含量的重要指標(biāo)之一。

進(jìn)一步通過(guò)高效液相色譜法對(duì)不同時(shí)期杭白芷根中主要藥用成分歐前胡素以及異歐前胡素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，在杭白芷根的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，歐前胡素、異歐前胡素以及總含量呈”S”型曲線增長(zhǎng),在5-7月份歐前胡素和異歐前胡素處于明顯上升期，在7-8月盛花期可能導(dǎo)致地下部分生長(zhǎng)緩慢，含量下降，在9月份歐前胡素以及總含量達(dá)到全年最高，而在9-10月份分泌道數(shù)量較多，增長(zhǎng)趨勢(shì)平穩(wěn)，因此進(jìn)一步說(shuō)明分泌道與香豆素類(lèi)藥用成分含量積累呈正相關(guān)，與藥材質(zhì)量關(guān)系緊密。