初永思，范曉丹，苑宏英，袁正通，李進(jìn)家，王學(xué)琦，程 序

（天津城建大學(xué)，天津300384）

染料廢水具有色度高、成分復(fù)雜、毒性大、難生物降解等特點，其常規(guī)處理方法包括混凝、膜分離、高級氧化和吸附等。然而這些方法普遍存在成本高、耗時長，產(chǎn)生二次污染等問題〔1-2〕，相比之下，生物法因操作簡單、運行成本低、不會造成二次污染而被廣泛應(yīng)用。近年來，人們致力于研發(fā)一些處理染料廢水的生物新方法， 研究主要集中在發(fā)現(xiàn)和培育各種具有高效脫色效果的菌株， 利用其生物降解染料廢水中的污染物。 已發(fā)現(xiàn)很多對染料廢水有降解作用的微生物，如細(xì)菌、真菌和藻類等〔3-4〕。 目前主要是依靠培育的特定細(xì)菌來降解染料廢水， 細(xì)菌可通過自身的新陳代謝將染料降解過程中產(chǎn)生的芳香胺等有毒物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)〔5〕，大大降低了印染廢水的危害。

本研究從活性污泥中篩選出對復(fù)雜染料廢水具有高效脫色能力的功能菌， 研究影響其脫色效果的因素，探究降解復(fù)雜染料廢水的機理。旨在研發(fā)對復(fù)雜染料廢水具有高效脫色性能的功能菌， 為高效功能菌用于處理復(fù)雜染料廢水提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 染料廢水

復(fù)雜染料廢水取自某印染工廠排放的廢水。

1.2 污泥馴化與菌種篩選

取200 mL 天津市某污水處理廠的活性污泥加入到500 mL 含復(fù)雜染料廢水培養(yǎng)基中進(jìn)行梯度馴化，每個梯度下染料廢水的色度、COD 趨于穩(wěn)定時馴化完成。 將馴化后的污泥按照不同倍數(shù)（10-4、10-5、10-6、10-7和10-8）稀釋后，取0.3 mL 均勻涂布于LB 固體培養(yǎng)基上，30 ℃下靜置培養(yǎng)2 d， 重復(fù)此步驟3~4 次，得到1 株對復(fù)雜染料廢水有高效脫色能力的功能菌。

1.3 培養(yǎng)基

LB 固體培養(yǎng)基：蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂粉、氯化鈉，pH 為7.0。

富集培養(yǎng)基：蛋白胨、酵母浸膏、氯化鈉，pH 為7.0。

脫色培養(yǎng)基：復(fù)雜染料廢水、葡萄糖、蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂、三氯化鐵、磷酸二氫鉀、無水氯化鈣，pH 為7.0。

1.4 菌種鑒定

提取菌株基因組DNA 作為模板，使用上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和下游引物1492R：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’進(jìn)行16S rDNA 擴增，凝膠電泳和純化回收等，將獲得的rDNA 序列通過BLAST 程序與GenBank 中的核酸數(shù)據(jù)比對分析進(jìn)行菌種鑒定。

1.5 菌種脫色試驗

將菌株N1 接種到200 mL 液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r/min 條件下富集得到菌液，將20 mL 菌液加入到200 mL 脫色培養(yǎng)基中進(jìn)行脫色試驗。在30 ℃、pH=7、葡萄糖、蛋白胨為碳氮源條件下靜置培養(yǎng)，每隔2 h 取上清液離心15 min，在538 nm處測定離心后上清液的吸光度，按式（1）計算脫色率。

式中：T——脫色率，%；

A——復(fù)雜染料廢水的初始吸光度；

At——染料廢水反應(yīng)后的吸光度。

1.6 菌株N1 對復(fù)雜染料廢水脫色的影響因素研究

由于大部分菌種最適生長溫度在25~37 ℃，最適pH 為5~9， 所以本研究在該范圍內(nèi)研究碳氮源、溫度、pH、復(fù)雜染料廢水初始濃度、NaCl 濃度以及菌種接種量對菌株N1 脫色能力的影響。 將20 mL 富集后的菌株N1 種子液接種到200 mL 脫色培養(yǎng)基中，在表1 所示條件下進(jìn)行脫色。

表1 影響因素

1.7 分析方法

將脫色液在8 000 r/min 下離心10 min，對原水水樣和上清液分別進(jìn)行紫外-可見光譜掃描（200~900 nm）、紅外光譜分析、固相萃取后GC-MS 分析。

2 結(jié)果討論與分析

2.1 脫色菌株鑒定

經(jīng)篩選純化后得到1 株對復(fù)雜染料廢水有高效脫色能力的菌株N1。 菌株N1 的氧化酶、MR 實驗、V-P 實驗及吲哚實驗均為陽性，其過氧化氫酶、葡萄糖發(fā)酵、明膠液化實驗、淀粉水解實驗均為陰性。

對該菌進(jìn)行PCR 擴增后測序，該序列與路德維希 氏 腸 桿 菌（Enterobacter ludwigiistrain）16S rDNA同源，一致性高達(dá)99.58%（見表2），判斷該菌為路德維希氏腸桿菌。

2.2 菌株N1 脫色影響因素

在pH=7、接種量為10%、鹽度1 g/L 條件下，考察了溫度對菌株N1 脫色效果的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20~40 ℃時菌株N1 對復(fù)雜染料廢水的脫色率隨溫度的升高呈先升高后降低的變化趨勢， 溫度在28~35 ℃時脫色效果顯著， 脫色率都可達(dá)到80%以上，35 ℃時其脫色率高達(dá)91.2%，40 ℃下脫色率明顯下降，僅為30%，因此菌株N1 最適溫度為35 ℃，屬于嗜中溫菌。 一般微生物的生長、繁殖、生物降解活性及污染物的溶解性受溫度的影響〔6〕，溫度過高或過低都會影響細(xì)菌體內(nèi)還原酶的活性， 導(dǎo)致菌株脫色能力發(fā)生變化。 Daizong Cui 等〔7〕研究表明，染料細(xì)菌脫色的最佳溫度范圍較窄，在25~37 ℃之間。 M.El Bouraie 等〔8〕研究嗜水性氣單胞菌降解染料活性黑5時發(fā)現(xiàn)， 嗜水性氣單胞菌在30~35 ℃下對活性黑5表現(xiàn)出良好的脫色能力， 說明嗜水性氣單胞菌屬于嗜中溫菌。

35 ℃下，鹽度為1 g/L、接種量為10%時，pH 對菌株N1 脫色效果如圖1 所示。

表2 菌株N1 16SrDNA 部分序列與GenBank 中其他序列的同源性對比

圖1 pH 對菌株N1 脫色效果的影響

由圖1 可見，pH 為2 時脫色率僅為40%左右，pH 為5~8 時菌株N1 對復(fù)雜染料廢水的脫色效果較為明顯，可達(dá)80%以上，pH 為7 時脫色率高達(dá)91%；當(dāng)pH 從7 增加到10 時脫色率快速下降，菌株N1 最適pH 為7。 菌株N1 適合在弱酸、中性、弱堿性條件下降解復(fù)雜染料廢水。R.Bibi 等〔9〕研究表明，克雷伯氏催產(chǎn)菌在最適pH 條件（pH=7）下對染料活性黑5 的脫色率為100%。 謝學(xué)輝等〔10〕認(rèn)為環(huán)境中的pH 過高或過低都會對微生物的生長和功能造成不利影響。 一般要求環(huán)境pH 為5~9，或最寬范圍為4~10，而最適宜pH 較窄，為6.5~7.5。 菌株N1 的降解特性與這些研究結(jié)果相似。

在35 ℃、pH=7、接種量為10%條件下，考察鹽度對菌株N1 脫色效果的影響，結(jié)果如表3 所示。

表3 鹽度對菌株N1 脫色效果的影響

由表3 可見，NaCl 質(zhì)量濃度低于5 g/L 時其脫色率超過85%，NaCl 為1 g/L 時脫色率最高， 可達(dá)91%，但鹽度高于5 g/L 后脫色率下降較快，鹽度為10 g/L 時脫色率僅為24%， 可能是由于高鹽度下細(xì)菌的滲透壓明顯下降，發(fā)生細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁的分離，從而導(dǎo)致細(xì)菌活性下降，最終影響脫色效果〔11〕?？芍闚1 并不適合降解高鹽度染料廢水。Z.W.Wang等〔12〕也發(fā)現(xiàn)鹽度對細(xì)菌脫色效果類似的影響。

在35 ℃、pH=7、鹽度為1 g/L 條件下，考察接種量對菌株N1 脫色效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 接種量對菌株N1 脫色效果的影響

如圖2 所示， 菌株N1 對染料的脫色率與接種量呈正相關(guān)， 接種量低于10%時對脫色率影響較大，接種量在10%~20%范圍內(nèi)增幅減緩，接種量為20%時在12 h 內(nèi)脫色效果顯著，超過12 h 后其脫色率與接種量為15%、10%的脫色率接近， 都可達(dá)到91%以上。 從經(jīng)濟(jì)效益角度考慮，菌株N1 的最佳接種量為10%。 這是由于接種量較小時，相同條件下培養(yǎng)基中的菌體量相對較小，因此脫色率不高，但接種量適當(dāng)增大時，在相同條件下有利于脫色〔13〕。

35 ℃、pH=7、接種量為10%、鹽度為1 g/L 時，碳氮源對菌株N1 脫色效果的影響如表4 所示。

表4 不同碳氮源下菌株N1 的脫色效果

由表4 可見，葡萄糖、蔗糖和淀粉為碳源時脫色率最高，均可達(dá)到84%以上，未投加碳源的脫色率僅為36%左右。蛋白胨作氮源時脫色效果較為明顯，脫色率達(dá)到92%， 尿素作氮源時的脫色率為83%，硫酸銨和亞硝酸鈉作為氮源時菌株N1 對染料廢水的脫色率均在70%左右，而未投加氮源的脫色率為49%。說明添加外源營養(yǎng)物后可顯著提高菌株N1 對復(fù)雜染料廢水的脫色效率。 這是由于碳源可以提供細(xì)胞生命活動所需能量，氮源是細(xì)菌合成蛋白質(zhì)、核酸的主要原料， 外加碳氮源提高菌株N1 脫色能力表明產(chǎn)生了共代謝作用， 即微生物從共代謝基質(zhì)中獲取能源降解一些難降解污染物的過程。 在細(xì)菌降解脫色染料廢水過程中， 提供合適的共代謝基質(zhì)能夠促進(jìn)細(xì)菌的降解脫色效果〔14-15〕。 這與大多數(shù)偶氮染料降解菌的研究結(jié)論基本一致〔16〕。

2.3 紫外-可見光譜分析

菌株N1 降解復(fù)雜染料廢水過程中的紫外-可見吸收光譜如圖3 所示。

圖3 菌株N1 降解復(fù)雜染料廢水前后的紫外吸收光譜

由圖3 可知，原水樣在538 nm 處出現(xiàn)最大吸收峰， 隨著降解反應(yīng)的進(jìn)行，4、6、8 h 的脫色溶液在538 nm 處的特征吸收峰逐漸減弱， 但在270 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰且逐漸增強， 反應(yīng)12 h 后538 nm處的吸收峰基本消失，270 nm 處的吸收峰降低，此時脫色率為93.3%， 說明廢水中的染料分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，發(fā)色基團(tuán)消失，同時含發(fā)色基團(tuán)的污染物被降解轉(zhuǎn)化為其他中間產(chǎn)物，12 h 后中間產(chǎn)物大部分被降解，導(dǎo)致吸收峰降低（見270 nm 處吸收峰）。

2.4 紅外光譜分析

染料廢水降解前后的紅外光譜見圖4。

圖4 菌株N1 降解復(fù)雜染料廢水前后紅外光譜圖

如圖4 所示，降解前，復(fù)雜染料廢水在1139.29cm-1處的峰歸屬于—C=O 的伸縮振動，1 384.24、3 439.57 cm-1歸屬于—NH2 和—OH 的伸縮振動，1 619.50 cm-1歸屬于—N=N—的伸縮振動，2 918、2 957.91 cm-1歸屬于—CH2的伸縮振動。

對比降解前后的紅外光譜可發(fā)現(xiàn)，1 139.29、1 619.50 cm-1處的—C=O 和—N=N—消失，表明復(fù)雜染料廢水中的發(fā)色基團(tuán)被破壞， 解釋了染料廢水的脫色原因；同時降解后的紅外光譜中出現(xiàn)—OH和—NH2的吸收峰，而圖3 中538 nm 處的吸收峰消失，270 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰，270 nm 處的吸收峰可能是芳香族化合物，表明降解后出現(xiàn)的—OH 和—NH2很可能是苯酚和芳香胺類物質(zhì)，但濃度較低，這也是染料分子降解過程中經(jīng)常出現(xiàn)的2 種中間產(chǎn)物〔17〕。

2.5 GC-MS 分析

為驗證紅外光譜中出現(xiàn)的—C=O、—N=N—降解為—OH 和—NH2， 采用GC-MS 對染料廢水的降解途徑進(jìn)一步分析， 其降解產(chǎn)物有1-萘甲醛（含—C=O）、3，5-二叔丁基苯酚（含—OH）、2-氨基苯乙酸（含—NH2）、3-（癸基氧基）-N-（2-丙烯基）丙酰胺（含—NH2）等。 由于實際染料廢水成分復(fù)雜，含—N=N—類物質(zhì)未被GC-MS 檢測到，但已檢測到含—NH2芳香類物質(zhì)，由此可推測染料廢水中發(fā)色基團(tuán)—C=O 經(jīng)菌株N1 降解后可能轉(zhuǎn)化為—OH，—N=N—經(jīng)菌株N1 降解后可能轉(zhuǎn)化為—NH2。

3 結(jié)論

（1）從活性污泥中馴化分離出復(fù)雜染料廢水高效脫色菌N1，經(jīng)鑒定為路德維希氏腸桿菌。

（2）隨著pH 和溫度的增加，菌株N1 對復(fù)雜染料廢水的脫色率均呈先升高后降低的趨勢， 溫度為35 ℃、pH 為7 時其脫色率分別達(dá)91.2%、93%。 增大NaCl 濃度，菌株N1 的脫色能力降低，鹽度為10 g/L時其脫色率僅為28%。 菌株N1 對復(fù)雜染料廢水降解的最佳條件：溫度為35 ℃，pH=7，鹽度低于5 g/L，最佳接種量為10%。 將葡萄糖和蛋白胨作為碳、氮源時， 可以顯著提高菌株N1 對復(fù)雜染料廢水脫色率。

（3）根據(jù)紅外光譜和GC-MS 的分析結(jié)果，菌株N1 降解復(fù)雜染料廢水過程中顯色基團(tuán)—C=O 和—N=N—消失，降解后出現(xiàn)—OH 和—NH2，結(jié)合紫外-可見光譜在270 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰， 判斷可能是苯酚和芳香胺類物質(zhì)， 兩者是染料分子降解過程中常出現(xiàn)的中間產(chǎn)物， 表明菌株N1 主要是通過生物降解途徑處理染料廢水。