寧東坡，張楊，肖培培，李敏，樊新麗，巴音查汗*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.兵團(tuán)第五師八十一團(tuán)農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，新疆 博樂市 833400)

羊泰勒蟲病(Ovine and caprine theileriosis)是由泰勒科泰勒屬(Theileria)的原蟲寄居在綿羊及山羊的紅細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)，并引發(fā)動(dòng)物出現(xiàn)高熱、出血、淋巴結(jié)腫脹及消瘦為主要病癥的疾病[1]，該病多呈急性經(jīng)過。該病在亞洲、非洲和中東地區(qū)的傳播較為廣泛，主要通過中間宿主蜱傳播，故其暴發(fā)和流行與媒介蜱的活動(dòng)密切相關(guān)。目前，共有6種羊泰勒蟲在國內(nèi)外流行，包括綿羊泰勒蟲(T.ovis)、呂氏泰勒蟲(T.luwenshuni)、尤氏泰勒蟲(T.uilenbergi)、萊氏泰勒蟲(Theilerialestoquardi)、隱藏泰勒蟲(T.recondita)和分離泰蟲(T.separata)[2-4]，而我國報(bào)道的多為綿羊、尤氏及呂氏泰勒蟲感染[5-7]。自1958年我國首次在四川省發(fā)現(xiàn)該病后，隨后在青海、甘肅、陜西、內(nèi)蒙古等地均有發(fā)現(xiàn)[8，9]；新疆的喀什、伊犁、阿克蘇、阿勒泰、巴州等地也均有發(fā)現(xiàn)[10-12]。

作為中國重要的羊產(chǎn)業(yè)養(yǎng)殖區(qū)，新疆的存欄數(shù)在我國居于前列，而新疆的復(fù)雜地貌使得媒介蜱種類及分布較為廣泛。本研究對新疆博爾塔拉蒙古自治州(簡稱博州)部分地區(qū)血液源性及蜱源性羊泰勒蟲的感染情況進(jìn)行了調(diào)查，以期為新疆羊泰勒蟲病采取有針對性的防控措施提供部分參數(shù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 樣本來源

2016—2019年，在博州地區(qū)的81團(tuán)、85團(tuán)、88團(tuán)、90團(tuán)、烏圖布拉格鎮(zhèn)、精河縣及溫泉縣采集綿羊(N=907)和山羊(N=613)血液及羊體表的蜱蟲(N=1 088)，共計(jì)采集血液1 520份、蜱蟲1 088只。血液樣品保存于EDTA抗凝管，-20℃儲(chǔ)存；蜱保存于采集管(提前在管蓋扎洞，并用紗布包裹管蓋，防止成蜱產(chǎn)卵掉落外界)中，標(biāo)注采集地點(diǎn)與采集時(shí)間，記錄后保存于實(shí)驗(yàn)室，待鑒定。

DNA Marker購自 TaKaRa 公司，2×Eco Taq PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，DNA提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.2 DNA提取

將蜱蟲研磨后進(jìn)行DNA提取，血液樣品直接進(jìn)行DNA提取，-20 ℃保存，備用。

1.3 綿羊泰勒蟲的PCR擴(kuò)增

PCR參照Allsopp等[7,13-15]擴(kuò)增18S rRNA目的片段；對提取的總DNA先進(jìn)行泰勒蟲18S rRNA擴(kuò)增(TE18S-F：5′-AGTTTCTGACCTATCAG-3′；TE18S-R：5′-TTGCCTTAAACTTCCTTG-3′；1 033 bp；53.8℃)，對擴(kuò)增為陽性的樣品再次進(jìn)行呂氏(T1-F：5′-GGTAGGGTATTGGCCTACTGA-3′；T1-R：5′-TCATCCGGATAATACAAGT-3′；380 bp；51℃)、尤氏(T2-F：5′-GGTAGGGTATTGGCCTACCGG-3′；T2-R：5′-ACACTCGGAAAATGCAAGCA-3′；380 bp；55℃)及綿羊泰勒蟲(T3-F：5′-TCGAGACCTTCGGGT-3′；T3-R：5′-TCCGGACATTGTAAAACAAA-3′；520 bp；53℃)18S rRNA 擴(kuò)增鑒定。

PCR擴(kuò)增體系為(退火溫度不同)：95 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、(53.8 ℃、51 ℃、55 ℃、53 ℃)30 s、72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 羊泰勒蟲18S rRNA 基因測序與序列分析

將PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性的產(chǎn)物進(jìn)行基因目的片段純化后送往上海生工進(jìn)行測序，用NCBI提供的 BLAST 軟件進(jìn)行比對分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 羊泰勒蟲病原PCR檢測結(jié)果

共采集到綿羊(N=907)和山羊(N=613)的血液1 520份和1 088只蜱，采用羊泰勒蟲通用引物擴(kuò)增后，共有329份羊血和40只蜱組織DNA中PCR結(jié)果為陽性，目的片段大小約1 033 bp，符合預(yù)測值(圖1)。特異性引物擴(kuò)增后，只出現(xiàn)約520 bp的目的條帶(圖2)。測序結(jié)果用BLAST比對，發(fā)現(xiàn)蜱源性和血源性綿羊泰勒蟲之間相似性為100%，與綿羊泰勒蟲18S rRNA基因序列(GenBank登錄號(hào)分別為：KT851435)的核苷酸相似性為98%(圖3)，最終確認(rèn)為綿羊泰勒蟲。

M.DNA Marker 2000；1.陽性對照；2.陰性對照；3-4.蜱蟲樣品；5-7.血液樣品。

M.DNA Marker 2000；1.蜱蟲樣品；2-3.血液樣品；4.陰性對照；5.陽性對照。

圖3 18S rRNA基因序列核苷酸相似性分析

2.2 不同地區(qū)羊泰勒蟲病的檢測結(jié)果

對新疆博州7個(gè)地區(qū)共1 520份血液檢測顯示，81團(tuán)、85團(tuán)、88團(tuán)、90團(tuán)、烏圖布拉格鎮(zhèn)、精河縣及溫泉縣的綿羊泰勒蟲感染率分別為25.82%(63/244)、24.59%(45/183)、24.66%(36/146)、19.85%(54/272)、26.15%(51/195)、20.18%(44/218)、13.74%(36/262)。對蜱蟲體內(nèi)攜帶綿羊泰勒蟲檢測結(jié)果的陽性率顯示：85團(tuán)、88團(tuán)、90團(tuán)、精河縣及溫泉縣分別為4.39%(5/114)、5.71%(10/175)、2.21%(3/136)、7.69%(15/195)、4.22%(7/166)；而81團(tuán)及烏圖布拉格鎮(zhèn)的蜱體內(nèi)均未檢測到羊泰勒蟲。詳情見表1。

表1 新疆部分地區(qū)羊泰勒蟲病的調(diào)查結(jié)果

2.3 不同飼養(yǎng)方式羊泰勒蟲病的檢測結(jié)果

新疆博州7個(gè)地區(qū)共1 520份不同飼養(yǎng)方式的羊群血液樣品感染結(jié)果表明：共計(jì)采集舍飼羊血液651份，陽性數(shù)為96份，感染率為14.75%；共計(jì)采集放牧羊血液869份，陽性數(shù)為233份，感染率為26.81%。放牧羊的感染率高于舍飼羊。

表2 新疆部分地區(qū)不同飼養(yǎng)方式羊泰勒蟲病的調(diào)查結(jié)果

3 討論與小結(jié)

博州位于我國新疆自治區(qū)準(zhǔn)噶爾盆地西緣，屬大陸性干旱半荒漠和荒漠氣候，日照時(shí)間長，晝夜溫差大，夏季高溫，適宜蜱蟲生長和繁殖，蜱蟲叮咬羊群后致使動(dòng)物長期處于帶蟲免疫狀態(tài)，且根除困難[1]。

患羊泰勒蟲病的動(dòng)物治愈后出現(xiàn)生長遲緩、產(chǎn)奶量以及產(chǎn)肉量下降，對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生非常不利的影響。當(dāng)前，我國報(bào)道的羊泰勒蟲主要為綿羊泰勒蟲、尤氏泰勒蟲及呂氏泰勒蟲，新疆報(bào)道的羊泰勒蟲病均為綿羊泰勒蟲病[10-12,16]。本研究針對新疆博州地區(qū)的羊泰勒蟲病感染分布情況進(jìn)行了調(diào)查。據(jù)不完全調(diào)查顯示，該區(qū)為羊泰勒蟲病的流行地區(qū)，血液源性和蜱源性羊泰勒蟲的感染率為21.64%(329/1 520)和3.68%(40/1 088)。但感染率低于之前報(bào)道的阿克蘇(58%)、伊犁(93.2%)及阿勒泰地區(qū)(22.41%)[10，11]。本次PCR檢測數(shù)據(jù)顯示，該區(qū)感染的是綿羊泰勒蟲，這和李佳、朱玉濤等[10,12]調(diào)查的結(jié)果一致。對于不同飼養(yǎng)方式的羊群進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，放牧羊(26.81%，233/869)的感染率明顯高于舍飼羊(14.75%，96/651)。對于該現(xiàn)象的原因可能是放牧地區(qū)多為草原，草坪上的蜱蟲較多，更易引發(fā)感染，而對于舍飼羊來說，環(huán)境衛(wèi)生相對較好，經(jīng)詢問，大部分畜主一般會(huì)在春秋季節(jié)在舍內(nèi)噴灑藥物，故感染率比放牧羊低。

羊泰勒蟲病的傳播和流行具有顯著的季節(jié)性與地區(qū)性，并和當(dāng)?shù)孛浇轵珙惖姆植济芮邢嚓P(guān)[17]。據(jù)報(bào)道，小亞璃眼蜱和森林革蜱是綿羊和山羊泰勒蟲病的主要傳播媒介[18]，是否存在其他傳播媒介蜱，需要后期繼續(xù)開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

該病的防治工作重點(diǎn)是做好預(yù)防及早期診斷，在春秋季節(jié)，對羊體表及圈舍等可能接觸病原的地方進(jìn)行滅蜱工作，采集血液樣品通過早期診斷篩選陽性病例并及時(shí)治療，最大限度地減少牧民的經(jīng)濟(jì)損失。