唐剛，吳斌，李君*，謝麗平，姜林龍，孟祥黔

(1. 西藏阜康婦產(chǎn)兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，拉薩 850000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，南充 637000；3.成都錦江區(qū)婦幼保健院生殖中心，成都 610016)

西藏地區(qū)被稱為“世界屋脊”，平均海拔4 000米以上，地域環(huán)境十分特殊，寒冷、低氧、低氣壓、強(qiáng)紫外線、異常干燥的氣候?qū)υ摰貐^(qū)男性和女性生育率有一定影響[1-2]。目前，西藏阜康婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心是西藏地區(qū)第一家開展“試管嬰兒”技術(shù)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，地處海拔3 650米的拉薩市區(qū)，也是全世界海拔最高的生殖醫(yī)學(xué)中心，且目前尚無其他機(jī)構(gòu)在海拔3 000米以上地區(qū)開展IVF-ET技術(shù)的報道。自從2016年報道了西藏地區(qū)首例試管嬰兒成功妊娠以來[3]，我中心在高海拔地區(qū)不斷探索體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI- ET)技術(shù)，現(xiàn)將2016年6月至2018年3月期間完成的303個治療周期的臨床結(jié)局做回顧性分析，旨在探討高海拔地區(qū)體外受精新鮮胚胎或凍融胚胎移植的臨床應(yīng)用價值。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2016年6月至2018年3月期間在西藏阜康婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受IVF/ICSI-ET治療的193例不孕癥患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)不孕年限≤10年；(2)無遺傳性及家族性病史；(3)不孕原因?yàn)榕枨惠斅压芤蛩鼗蚰蟹揭蛩亍Ｅ懦龢?biāo)準(zhǔn)：(1)有習(xí)慣性流產(chǎn)史；(2)子宮畸形、合并子宮肌瘤、子宮腺肌癥；(3)取消移植及合并移植周期的。根據(jù)女方患者年齡分為≤35歲組和>35歲組，每組又分為新鮮周期組和凍融周期組。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COH)方案：根據(jù)不孕患者年齡、基礎(chǔ)激素水平等采用長方案或短方案。于月經(jīng)第2天或第3天采用尿促性素(HMG)或卵泡刺激素(FSH)促排卵，B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，當(dāng)B超顯示有至少3個直徑≥18 mm的卵泡時，給予肌肉注射HCG(珠海麗珠制藥)5 000～10 000 U，35～36 h后行經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下卵泡穿刺取卵術(shù)。

2.IVF/ICSI及胚胎培養(yǎng)：精液處理采用上游法或密度梯度離心法。卵子及胚胎培養(yǎng)選擇澳大利亞COOK或瑞典Vitrolife序貫培養(yǎng)液，采用序貫法培養(yǎng)：培養(yǎng)箱CO2濃度設(shè)定為4.5%、O2濃度設(shè)定為5.5%；氣體濃度監(jiān)測儀日常檢測結(jié)果范圍：CO2濃度4.5%～4.7%，O2濃度5.4%～5.6%；提前準(zhǔn)備的培養(yǎng)液須在培養(yǎng)箱內(nèi)平衡8 h以上再使用；觀察原核及胚胎發(fā)育情況；評估胚胎質(zhì)量級別；選擇新鮮可用胚胎移植，其他可用胚胎冷凍保存，或者將全部可用胚胎冷凍保存，擇期行解凍復(fù)蘇移植。行常規(guī)IVF或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)。

3.臨床結(jié)局診斷：移植后14 d采血，全血β-HCG值≥10 U/L即為HCG陽性。移植后35 d行B超檢查觀察到宮內(nèi)孕囊和胎心搏動診斷為臨床妊娠[4]。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般資料比較

本研究共納入193例患者，303個治療周期，其中78個新鮮胚胎移植周期和225個凍融胚胎移植周期?！?5歲組的新鮮周期組納入65個周期、凍融周期組納入173個周期，兩組間患者年齡、體重指數(shù)、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)目均無顯著差異(P>0.05)。>35歲組的新鮮周期組納入13個周期、凍融周期組納入52個周期，兩組間患者年齡、體重指數(shù)、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)目亦均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

二、臨床結(jié)局比較

1.不同年齡組的實(shí)驗(yàn)室觀察指標(biāo)比較：≤35歲組的獲卵數(shù)顯著高于>35歲組(P<0.05)，但兩組間正常受精率和D3優(yōu)質(zhì)胚胎率無顯著差異(P>0.05)(表2)。

表1 不同年齡組新鮮周期和凍融周期患者的一般情況比較(-±s)

表2 不同年齡組早期胚胎發(fā)育結(jié)局的比較[(-±s)，%]

2.不同年齡組內(nèi)新鮮周期與凍融周期妊娠結(jié)局比較：≤35歲組中，與新鮮周期組相比較，凍融周期組的臨床妊娠率、種植率以及活產(chǎn)率均較高，但無顯著差異(P>0.05)，且兩組間的流產(chǎn)率、異位妊娠率以及多胎率的亦均無顯著差異(P>0.05)。>35歲組中，與新鮮周期組相比較，凍融周期組的臨床妊娠率、種植率以及活產(chǎn)率也是均較高，但無顯著差異(P>0.05)，且兩組間的流產(chǎn)率以及多胎率亦無顯著差異(P>0.05)，兩組均無異位妊娠發(fā)生(表3)。

表3 不同年齡組新鮮周期和凍融周期患者的妊娠結(jié)局比較(%)

3.新鮮周期不同年齡組妊娠結(jié)局比較：≤35歲組的臨床妊娠率、種植率、活產(chǎn)率雖高于>35歲組，但無顯著差異(P>0.05)，兩組流產(chǎn)率亦無顯著差異(P>0.05)(表4)。

4.凍融周期不同年齡組妊娠結(jié)局比較：≤35歲組的種植率、活產(chǎn)率顯著高于>35歲組(P<0.05)，但兩組間臨床妊娠率和流產(chǎn)率無顯著差異(P>0.05)(表5)。

表4 新鮮周期不同年齡組患者妊娠結(jié)局的比較(%)

表5 凍融周期不同年齡組患者妊娠結(jié)局的比較(%)

討 論

西藏自治區(qū)位于世界屋脊之稱的青藏高原，平均海拔4 000米以上，常住人口約320萬，不孕不育患者約有11萬人。缺氧干燥的特殊氣候使該地區(qū)不孕不育患者具有獨(dú)特的臨床特征，患病率相比平原地區(qū)較高[1-2]。西藏地區(qū)輔助生殖技術(shù)(ART)起步較晚，不孕癥人群年齡偏大，西藏阜康婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心地處海拔3 650米的拉薩市區(qū)，成功開展試管嬰兒技術(shù)，填補(bǔ)了西藏地區(qū)在該技術(shù)領(lǐng)域的空白[3]。

由于拉薩地區(qū)高海拔、低氣壓、相對濕度過低的極端氣候，這些環(huán)境因素可能對胚胎實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件造成負(fù)面影響，因此胚胎實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制顯得十分重要。我中心制定了嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控制度，包括環(huán)境質(zhì)控、培養(yǎng)箱等設(shè)備質(zhì)控、培養(yǎng)液及耗材的質(zhì)控。實(shí)驗(yàn)及手術(shù)區(qū)均安裝了層流凈化空調(diào)，由于室外環(huán)境相對濕度較低，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)增置加濕器，使相對濕度維持在40%～60%，實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)溫度維持在22℃～25℃，溫濕度每天檢測，每月進(jìn)行沉降菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

胚胎培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性是胚胎實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，除了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境之外，培養(yǎng)液直接接觸胚胎，模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育環(huán)境，是胚胎生長發(fā)育的關(guān)鍵點(diǎn)[5-6]。因此摸索培養(yǎng)液在海拔3 650米的穩(wěn)定性和最佳pH值極其重要。目前國內(nèi)外IVF實(shí)驗(yàn)室均使用商品化的培養(yǎng)液，適合胚胎生長發(fā)育的最佳pH值范圍7.2～7.4已基本形成共識。不同品牌的培養(yǎng)液對培養(yǎng)箱CO2濃度有各自的規(guī)定，COOK培養(yǎng)液生產(chǎn)商建議海拔3 650米的拉薩市區(qū)，應(yīng)將培養(yǎng)箱的CO2濃度設(shè)定在9.5%～10%，我中心利用血?dú)夥治鰞x檢測COOK培養(yǎng)液(受精液、卵裂液、囊胚液)在不同CO2濃度(4.5%～7.0%)下平衡不同時間(12 h、24 h、48 h、72 h)后的pH值變化情況，并利用鼠胚實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證胚胎培養(yǎng)環(huán)境的可靠性，結(jié)果顯示：隨著CO2濃度升高，pH值呈整體下降趨勢，濃度高于7%時，pH值已低于7.2。經(jīng)過對比，在4.5% CO2濃度下，培養(yǎng)液平衡不同時間的pH值變化較小且均在生產(chǎn)廠商規(guī)定的使用范圍內(nèi)(7.3～7.5)，同時鼠胚發(fā)育良好，達(dá)到IVF實(shí)驗(yàn)室的胚胎培養(yǎng)條件，但這與培養(yǎng)液生產(chǎn)商提供的數(shù)據(jù)并不相符[7]。

將本研究中的新鮮周期≤35歲組和>35歲組患者臨床妊娠率(36.92% vs. 23.08%)與平原地區(qū)的安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心(安徽合肥，海拔100米以下)2014年報道的數(shù)據(jù)(37.46% vs. 25.97%)[8]以及河南省人民醫(yī)院生殖中心(河南鄭州，海拔約100米)報道的數(shù)據(jù)(48.27% vs. 30.25%)[9]相比較，均無顯著差異(P>0.05)。凍融周期≤35歲和>35歲患者臨床妊娠率(49.71% vs. 40.38%)，與國內(nèi)某些低海拔平原地區(qū)，如河南省人民醫(yī)院生殖中心2018年報道的數(shù)據(jù)(55.22% vs. 41.39%)[9]、無錫市婦幼保健院生殖中心(江蘇無錫，海拔8米)報道的數(shù)據(jù)(52.42% vs.37.40%)[10]相比較，均無顯著性差異(P>0.05)。然而，凍融周期總體妊娠成功率(47.55%)顯著低于韶關(guān)婦幼保健院(廣東韶關(guān)，海拔35米)報道的數(shù)據(jù)(55.48%)[11](P<0.05)，可見缺氧、寒冷干燥、低氣壓的氣候?qū)VF-ET技術(shù)可能會有影響，但事實(shí)證明在海拔3 650米地區(qū)實(shí)施體外受精-胚胎培養(yǎng)-胚胎移植技術(shù)助孕是完全可行的。

本研究得到的≤35歲組新鮮周期和凍融周期的活產(chǎn)率(32.31% vs.41.04%)，低于平原地區(qū)(河南鄭州)的水平(42.73% vs. 47.33%)[9]以及無錫市婦幼保健院報道的<35歲活產(chǎn)率(44.43%)[10]，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；流產(chǎn)率(12.50% vs.17.44%)略高于平原地區(qū)(河南鄭州)(11.48% vs. 14.28%)[9]，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。也可能由于本研究周期數(shù)偏少，結(jié)果不準(zhǔn)確所致，或者是因?yàn)楦咴貐^(qū)和平原地區(qū)地理環(huán)境差異性所致，尚待進(jìn)一步研究明確。

本研究結(jié)果顯示，與≤35歲組相比較，>35歲組的凍融周期活產(chǎn)率、種植率均顯著降低，這與國內(nèi)其他地區(qū)的的報道相一致[8-10，12]，表明了女性年齡依然是影響IVF-ET成功率的重要因素。隨著女性年齡的增長，卵巢儲備功能越差，IVF治療獲得的卵泡數(shù)越少，最終影響妊娠成功率[13-14]；另外，卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量和功能逐漸下降，能量供應(yīng)不足影響細(xì)胞分裂；活性氧自由基(ROS)增加，對線粒體DNA和蛋白質(zhì)造成損傷，影響了微管和微絲間的動態(tài)平衡，導(dǎo)致卵母細(xì)胞染色體異常分離和非整倍體的產(chǎn)生，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)減少，種植率和臨床妊娠率顯著降低，胚胎染色體異常率及流產(chǎn)率增加[15]。本研究結(jié)果顯示兩個不同年齡組的臨床妊娠率和流產(chǎn)率無顯著性差異，原因可能是>35歲組周期數(shù)較少，統(tǒng)計結(jié)果不準(zhǔn)確所致。還有研究認(rèn)為，較高劑量的Gn會影響卵母細(xì)胞的正常分裂、代謝，改變其表觀遺傳學(xué)特征，使胚胎發(fā)育潛能降低；另外，隨著年齡增長，女性子宮內(nèi)膜形態(tài)和功能也會發(fā)生一系列變化，比如：子宮內(nèi)膜血供減少、內(nèi)膜病理性變化增加、內(nèi)膜細(xì)胞性激素受體減少等，均可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降，胚胎種植率降低[16-17]。

隨著胚胎玻璃化冷凍技術(shù)的不斷改進(jìn)和廣泛應(yīng)用，越來越多研究證明凍融周期的臨床妊娠率、種植率和活產(chǎn)率均高于新鮮移植周期。2016年，Chen等[18]首次證實(shí)在多囊卵巢綜合征患者中，凍融周期胚胎移植與新鮮周期胚胎移植相比可以顯著提高新生兒的活產(chǎn)率。Ozgur等[19]的研究也證實(shí)凍融周期能夠獲得與新鮮移植周期相似甚至更好的臨床結(jié)局。趙華等[9]的研究認(rèn)為由于促排卵周期患者的激素水平較高，導(dǎo)致著床窗口期提前關(guān)閉，使胚胎發(fā)育與內(nèi)膜容受性不能同步化，使新鮮胚胎移植臨床妊娠率顯著低于凍融周期。本研究結(jié)果顯示無論>35歲組，還是≤35歲組，凍融周期的臨床妊娠率、種植率、活產(chǎn)率均高于新鮮周期組，但無顯著差異(P>0.05)。本研究納入的≤35歲新鮮周期組65個周期，>35歲新鮮周期組僅13個周期，周期數(shù)偏少，明顯少于凍融周期數(shù)量。主要因?yàn)槲抑行脑谄鸩诫A段，考慮到高海拔地區(qū)的特殊性，也為保證臨床妊娠率和避免卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生，多數(shù)患者選擇了全胚冷凍策略，待技術(shù)逐漸成熟后，會進(jìn)一步擴(kuò)大新鮮胚胎移植周期。

綜上所述，在海拔3 650米西藏地區(qū)開展IVF-ET助孕技術(shù)可以獲得較好的臨床結(jié)局，女性年齡仍然是影響IVF-ET成功率的關(guān)鍵因素，為高海拔地區(qū)“試管嬰兒”技術(shù)的臨床應(yīng)用價值提供數(shù)據(jù)支持。但目前IVF-ET治療周期數(shù)量有限，有關(guān)影響海拔3 650米地區(qū)IVF-ET成功率的因素，有待進(jìn)一步深入研究。