倪運萍，陸杉，盧興宏，徐珉，劉娟，王愛愛，袁啟龍，謝妍，楊冬宇，周文

(廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，廣州 510006)

自1992年比利時學者Palermo等[1]報道采用卵胞漿內單精子注射技術(ICSI)成功使不育患者獲得妊娠以來，其技術越來越成熟，中國輔助生殖界已將ICSI技術列為解決男性嚴重少、弱、畸及無精子癥患者生育的最佳選擇[2]，讓越來越多的男性嚴重精子異常不育患者獲得了生育子代的機會。

隨著冷凍技術的發(fā)展，凍融胚胎移植(FET)不斷增加，在評估輔助生殖技術(ART)助孕療效時，大部分文獻研究均關注其整體患者的最終助孕結局，并就累積活產率提出了越來越多的探討[3-5]，卻較少有文獻對因特定因素行助孕治療的最終結局進行分析。本研究對因男方嚴重少精子癥為主要指征納入ICSI治療的患者助孕結局進行分析，以單個取卵周期為節(jié)點報道累積臨床妊娠率及累積活產率。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2014年1月至2019年9月在本院生殖醫(yī)學科以男方嚴重少精子癥(精子濃度<5×106/ml)為主要適應證接受ICSI治療的187對不育夫婦為研究對象。其中8對夫婦女方染色體無異常，男方伴有引起不育或流產的染色體異常(包括染色體微缺失)，單獨列出分析。因此，最終納入179對不育夫婦的240個取卵周期的助孕數據，按照女方年齡分為≤35歲組、36～39歲組、≥40歲組；按照獲卵數不同分為≤5枚組、6～10枚組、11～15枚組、≥16枚組。

納入標準：以男方嚴重少精子癥(包括嚴重少弱精子癥)為主要適應證納入ICSI治療；夫妻雙方染色體檢測正常(可包含染色體正常多態(tài)性不影響生育者)。排除標準：合并女方因素引起的不孕癥，如存在引起著床失敗的宮腔因素/患有Ⅲ期-Ⅳ期子宮內膜異位癥/子宮腺肌癥等；供卵、供精及代孕治療患者；行胚胎移植前遺傳學檢測(PGT)患者。

二、研究方法

1.促排卵方案：符合因男方嚴重少精子癥擬行ICSI助孕標準的夫婦，女方進行促排卵治療，促排卵方案選擇標準如下：(1)常規(guī)采用長方案或拮抗劑方案治療；(2)選擇微刺激方案或黃體期促排卵方案治療的患者：低反應患者，長方案或拮抗劑方案獲卵數≤3個未獲得妊娠者，AFC≤3個者。

2.取卵及受精：女方卵泡達到常規(guī)取卵標準后，晚上注射人絨毛膜促性腺激素(珠海麗珠)5 000～10 000 U，或重組人絨毛膜促性腺激素(默克雪蘭諾，瑞士)250 μg；拮抗劑方案為預防卵巢過度刺激綜合征(OHSS)發(fā)生采用醋酸曲普瑞林(輝凌，瑞士)0.2 mg扳機，36～38 h后行經陰道B超引導下取卵。精子獲得均為手淫取精方式獲取，處理采用直接洗滌法，授精方式為ICSI。

3.胚胎移植及黃體支持：新鮮周期移植患者取卵后第3日進行卵裂期胚胎移植，或取卵后第5日進行囊胚移植；凍融周期移植患者轉化內膜第4日行卵裂期胚胎移植或第6日行囊胚移植。取卵后當日或凍融周期轉化內膜日即開始給予黃體酮注射液(湖南康都)40 mg/d肌肉注射，或使用陰道黃體酮凝膠(默克雪蘭諾，瑞士)90 mg/d陰道給藥，并加用地屈孕酮(雅培，美國)20 mg/d口服。

4.隨訪及觀察指標：胚胎移植后隨訪至分娩。觀察指標為獲卵數、可利用胚胎數、無可利用胚胎率、平均移植胚胎數(包括卵裂期胚胎和囊胚)、平均移植優(yōu)胚數(包括優(yōu)質卵裂期胚胎和優(yōu)質囊胚)、累計臨床妊娠率、活產率。本研究中累積活產率的計算參照2018年中國專家共識進行，以單個取卵周期累積活產率進行計算[6]。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件進行數據處理。計量資料比較采用單因素ANOVA檢驗，組間計量資料比較采用LSD法；計數資料采用χ2檢驗及Fisher’s精確檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、一般情況

179對夫婦接受240個ICSI助孕周期治療，女方取卵次數為1～6次，15個取卵周期未獲得可利用胚胎，20個取卵周期在全胚冷凍后尚未進行胚胎移植，隨訪單個取卵周期累積臨床妊娠率為61.36%(135/220)，28個取卵周期移植后尚在持續(xù)妊娠中，7個取卵周期(5.19%，7/135)發(fā)生自然流產，2個取卵周期(1.48%，2/135)發(fā)生異位妊娠；截至目前隨訪單個取卵周期累積活產率為50.00%(96/192)。

二、不同女方年齡分層助孕情況及妊娠結局比較

≤35歲組、36～39歲組、≥40歲組進行比較，獲卵數、可利用胚胎數、累積臨床妊娠率及活產率均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，隨著女方年齡的增加，獲卵數、可利用胚胎數、累積臨床妊娠率及累積活產率均呈下降的趨勢?！?0歲組無可利用胚胎率顯著高于其他兩組(P<0.05)；≤35歲組、36～39歲組兩組間無可利用胚胎率比較無顯著性差異(P>0.05)。3組平均移植胚胎數比較無顯著性差異(P>0.05)。平均移植優(yōu)質胚胎數比較，僅≤35歲組顯著高于≥40組(P<0.05)，其余兩組比較無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同女方年齡組間助孕結局比較[(-±s)，%]

三、不同獲卵數分層助孕情況及妊娠結局比較

不同獲卵數組間比較，隨著獲卵數的增加，可利用胚胎數顯著增加(P<0.05)。獲卵數≥6枚的各組與≤5枚組比較，女方年齡、無可利用胚胎率、平均移植胚胎數、平均移植優(yōu)胚數、累積臨床妊娠率、累積活產率均顯著升高(P<0.05)。獲卵數6～10枚、11～15枚及≥16枚組間比較，女方年齡、無可利用胚胎率、平均移植胚胎數、平均移植優(yōu)胚數、累積臨床妊娠率及累積活產率均無顯著性差異(P>0.05)，但隨著獲卵數的增加，累積臨床妊娠率及累積活產率仍有增加的趨勢(表2)。

表2 不同獲卵數組間助孕結局比較[(-±s)，%]

四、獲卵數≤5枚患者不同年齡分層的助孕結局比較

將獲卵數少(≤5枚)的患者分為≤35歲組和>35歲組，數據顯示，≤35歲組的累積臨床妊娠率及累積活產率均顯著高于>35歲組(高齡患者)(P<0.05)；≤35歲、>35歲組間無可利用胚胎率、平均移植胚胎數及平均移植優(yōu)胚數比較無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 獲卵數≤5枚患者不同年齡分層助孕結局比較[(-±s)，%]

五、男方染色體異常患者助孕結局

共有8對合并男方染色體異常(影響生育)的夫婦接受了13個取卵周期治療，占比4.28%(8/187)；其中7例患者伴有Y染色體微缺失，占比3.74%(7/187)。這部分患者在接受ICSI助孕前，均已接受遺傳咨詢，已知情了解相關可能存在的遺傳風險，患者均要求行ICSI助孕治療，暫拒絕行與性別相關的PGT治療。1例患者取卵2個周期，總獲卵33枚，但均為未成熟卵，兩個周期均未獲得可利用胚胎；1例患者取卵1個周期，獲卵22枚，僅獲得2枚可利用胚胎，FET未獲得妊娠；另1例患者取卵2個周期，共獲卵17枚，獲得3枚可利用胚胎，移植后未獲得妊娠。余5例患者共6個取卵周期獲得臨床妊娠，單個取卵周期累積臨床妊娠率為46.15%(6/13)。1例47，XY，+mar患者早期自然流產，之后移植未再獲得妊娠。4例患者共4個取卵周期獲得活產分娩，單個取卵周期累積活產率為30.78%(4/13)，1例分娩1名男嬰，其余3例各分娩1名女嬰。活胎分娩患者中，其中1例患者第1取卵周期發(fā)生異位妊娠，第 2取卵周期獲得活胎分娩；另1例患者新鮮周期移植妊娠后發(fā)生自然流產，FET周期獲得活胎分娩(表4)。

表4 染色體異?；颊咧薪Y局

討 論

近年來，ICSI技術解決了男性嚴重少精子癥患者的生育問題，但目前鮮見因男方嚴重精子異常行ICSI治療累積臨床妊娠率及活產率的報道。因此，本研究關注因男性因素接受助孕治療患者的臨床結局，并按女方年齡及獲卵數不同分層對單個取卵周期累積臨床妊娠率、累積活產率進行分析。研究結果顯示，即使對于因男方因素接受ICSI助孕治療的夫婦，女方助孕年齡仍然是決定ICSI治療結局的關鍵因素，隨著女方年齡的增加，獲卵數、可利用胚胎數、累積臨床妊娠率與累積活產率均呈下降趨勢；40歲后平均移植優(yōu)胚數下降，考慮與獲卵數及卵子質量下降有關。Malizia等[7]對6 164例患者的14 248個取卵周期的活產率進行統(tǒng)計發(fā)現，IVF治療可使絕大多數年輕女性獲得活產，但不能逆轉年齡所帶來的妊娠率下降。De Neubourg等[8]對年齡進行分層后認為，年齡是累積活產率的直接影響因素，隨著年齡的增加，累積活產率顯著降低，從<35歲的62.9%降至35～37歲的51.4%，38～40歲為34.1%，41～42歲僅為17.7%。

一般認為，獲卵數增加會帶來可利用胚胎數增加，進而累積臨床妊娠率及累積活產率相應升高。本研究中獲卵數6～10枚、11～15枚及≥16枚組間比較，女方年齡、無可利用胚胎率、累積臨床妊娠率及累積活產率均無顯著性差異，但累積臨床妊娠率及累積活產率隨獲卵數增加呈現增加的趨勢；與之前文獻報道的隨獲卵數增加累積活產率顯著增加存在一定的差異，考慮與納入病例數量有限有關[9]。同時我們發(fā)現獲卵數為6～10枚時可獲得較好的臨床結局。過度增加獲卵數會增加OHSS的風險[10-12]，繼而增加患者的不適及經濟負擔。本研究結果也顯示當獲卵數≤5枚時，無可利用胚胎率顯著增加，單個取卵周期平均移植胚胎數及移植優(yōu)胚數明顯下降，最終導致累積臨床妊娠率及累積活產率顯著下降，這與之前文獻[7]結論相似，考慮可能與女性年齡增加有關。

本研究分析低反應(獲卵數≤5枚)患者接受ICSI治療發(fā)現，年輕患者(≤35歲)即使獲卵數較少，單個取卵周期仍可獲得33.33%的累積活產率，而高齡(>35歲)低反應患者累積活產率僅為8.33%，進一步提示ICSI治療中女方年齡仍是最關鍵的因素。與Shi等[13]的結論相似，即正常反應與低反應年輕患者的累積活產率與種植率相似，而高齡患者即使獲卵數較多，其臨床結局亦不如年輕低反應患者。Xu[14]等的分析亦認為38歲之后低反應患者累積活產率明顯低于<35歲患者，43歲之后累積活產率僅達到4.4%。另外，本研究對于低反應患者，若使用長方案或拮抗劑方案其獲卵數≤3個而最終未獲得妊娠者，或AFC≤3個者我們參考文獻選擇微刺激方案或黃體期促排卵方案治療[15-16]，部分患者已獲益并獲得活胎分娩。

根據現有數據，我們初步認為獲卵數相對較少的年輕女性即使合并男方嚴重少精子癥也有望助孕成功，可建議及時積極助孕治療；而高齡女性患者卵子質量下降，獲卵數相對減少，合并男方精子嚴重異常時雙方無法相互補救，無法獲得高質量、發(fā)育潛能好的胚胎，容易導致助孕失敗。

本研究中有8例(4.28%)男性患者伴有影響生育的染色體異常，其中7例(3.74%)為Y染色體微缺失患者；4例(50%)患者獲得活胎分娩。這部分患者在接受ICSI治療前已進行遺傳咨詢，告知相關遺傳風險，建議考慮行PGT治療，但因患者對于性別選擇較為排斥，均要求行ICSI治療。文獻報道，男性原發(fā)無精子癥和少精子癥患者中約3%～15%存在Y染色體AZF區(qū)域微缺失，提示這可能是男性原發(fā)不育的一個重要遺傳學病因[17]。有學者認為Y染色體微缺失患者有生育子代的可能[18]，此類患者可通過ICSI技術獲得生育后代的機會，但由于Y染色體是單倍體，會垂直遺傳給下一代，即進行ART治療會將這種微缺失遺傳給男性子代。本研究中1例Y染色體微缺失患者生育1男胎，意味著這種Y染色體微缺失通過ICSI技術傳遞給了下一代，很可能使下一代將來同樣面臨著不育的問題。另1例47，XY，+mar(額外小染色體)患者，在本中心助孕3周期，其中1周期移植獲得妊娠后早期自然流產，之后未再獲得臨床妊娠。額外小染色體(extra small chromosome)，也稱超數染色體(supernumerary chromosome)，是指一類多于正常染色體數(2N)的小染色體。群體細胞遺傳學的研究證實，額外小染色體以一定的發(fā)生頻率(0.2‰)存在于人類群體中[19]。Buekton等[20]對大范圍人群進行篩選研究后發(fā)現生育力低下人群額外小染色體mar的發(fā)生率較高。mar對男性攜帶者生育力的影響較女性更為嚴重，我國也有少數文獻報道其與男性嚴重精子異常及自然流產存在一定的關系[21-23]。

但因納入數據樣本量的限制，我們暫未將不同促排卵方案、不同時期胚胎等因素納入比較，這也使數據基線統(tǒng)一性存在一定的限制，期待后續(xù)能通過多中心合作擴大數據樣本量、矯正數據基線以進行更科學地數據分析。

綜上，男方嚴重少精子癥患者助孕結局仍然與女方年齡及獲卵數有關，這與常規(guī)IVF治療所獲得的數據一致，對于男方因素引起的不育癥建議夫婦雙方盡早接受助孕治療，以免錯過最佳助孕時機，增加治療費用及失敗幾率。對于合并影響生育的男性染色體異?；颊?，在接受助孕治療前需給予充分遺傳咨詢，告知ART后可能面臨自然流產、子代生殖健康等各類風險，并建議其盡量選擇PGT治療減少遺傳風險。