楊小璇，王菁，沈鑒東，謝佳孜，崔毓桂，劉嘉茵，吳畏

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京 210000)

在備孕夫婦中，有20%面臨不孕困擾，其中約三分之一的病例由男性因素引起[8-9]。男性精子DNA碎片指數(shù)(DNA fragmentation index，DFI)作為傳統(tǒng)精液分析的補(bǔ)充，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，是預(yù)測(cè)男性生育力有價(jià)值的指標(biāo)[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)DFI可能對(duì)胚胎非整倍體的發(fā)生具有潛在影響[12]。

本研究對(duì)行PGT助孕患者進(jìn)行多種組間分類，分析不同類型患者染色體異常率及胚胎異常率的差異及妊娠結(jié)局，為深入理解胚胎染色體異常的發(fā)生提供思路，為PGT技術(shù)應(yīng)用人群的選擇提供臨床依據(jù)。

材料與方法

一、研究對(duì)象及分組

回顧性分析2011年6月至2019年12月于本中心行PGT助孕的1 602個(gè)取卵周期及對(duì)應(yīng)的復(fù)蘇周期。其中有1 066個(gè)周期進(jìn)行了DFI檢測(cè)。

1.根據(jù)夫婦雙方是否有染色體核型異常分組：(1)夫婦雙方染色體核型均正常的分為：有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病史(PGT-A)組和無(wú)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史但有遺傳病生育風(fēng)險(xiǎn)(PGT-M)組。(2)夫婦雙方至少一方染色體核型異常的，根據(jù)染色體核型分為普通易位組和羅氏易位組。再根據(jù)染色體易位發(fā)生的性別差異分組：普通易位組中，易位發(fā)生在女方為A組、易位發(fā)生在男方為B組；羅氏易位組中，易位發(fā)生在女方為C組、易位發(fā)生在男方為D組。

2.根據(jù)精子DFI檢測(cè)結(jié)果，以20%為臨界值分為低DFI組和高DFI組。

二、研究方法

1.促排卵方案：所有患者均采用合適的促排卵方案。當(dāng)主導(dǎo)卵泡的直徑達(dá)到18 mm左右，注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)，36 h后陰道超聲引導(dǎo)下行取卵術(shù)。使用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析(sperm chromatin structure assay，SCSA)作為DFI檢測(cè)方法。

2.胚胎檢測(cè)：使用微陣列-比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridiza-tion，aCGH)或二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)進(jìn)行囊胚活檢或卵裂球活檢。胚胎異常率=非整倍體胚胎數(shù)目/活檢胚胎數(shù)目；染色體異常率=非整倍體胚胎的異常染色體總條數(shù)和/(活檢胚胎數(shù)目×46)。MⅡ受精率=受精卵數(shù)/MⅡ卵子數(shù)；卵裂率=發(fā)生卵裂的受精卵數(shù)/總受精卵數(shù)；D3胚胎形成率=形成D3胚胎數(shù)/發(fā)生卵裂的受精卵數(shù)；囊胚形成率=形成囊胚數(shù)/D3胚胎數(shù)。

3.妊娠結(jié)局隨訪：移植后2周隨訪血清β-HCG，β-HCG>25 U/L時(shí)為HCG陽(yáng)性，停經(jīng)50 d左右行陰道超聲檢查，記錄宮腔孕囊數(shù)目和心管搏動(dòng)確定臨床妊娠；停經(jīng)70 d第二次陰道超聲檢查了解胚胎發(fā)育情況；后期電話隨訪流產(chǎn)或活產(chǎn)情況。HCG陽(yáng)性率=HCG陽(yáng)性周期數(shù)/取卵周期數(shù)；累積妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/取卵周期數(shù)；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)；累積活產(chǎn)率=活產(chǎn)數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)。

養(yǎng)殖場(chǎng)衛(wèi)生環(huán)境較差，通風(fēng)不良，糞便不能及時(shí)清理，濕度較大，導(dǎo)致蟲(chóng)卵生長(zhǎng)發(fā)育，也有利于螨蟲(chóng)的寄生活動(dòng)。因此，要高度重視養(yǎng)殖舍衛(wèi)生環(huán)境控制，強(qiáng)化養(yǎng)殖舍通風(fēng)換氣，減少成蟲(chóng)寄生場(chǎng)所，控制養(yǎng)殖舍內(nèi)害蟲(chóng)密度，一旦鵝群出現(xiàn)不安現(xiàn)象，應(yīng)該及時(shí)查明原因，及時(shí)采用藥物消滅成蟲(chóng)，將病情控制在萌芽階段，將損失降低到最小程度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、PGT-A組和PGT-M組一般資料、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和妊娠結(jié)局比較

PGT-A組納入308個(gè)周期，檢測(cè)1 174枚胚胎；PGT-M組納入108個(gè)周期，檢測(cè)338枚胚胎。兩組在女方年齡、男方年齡、女方體重指數(shù)(BMI)、血清基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH和抗苗勒管激素(AMH)水平方面，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

與PGT-M組相比較，PGT-A組的D3胚胎形成率、囊胚形成率顯著降低(P<0.05)；染色體異常率、胚胎異常率顯著升高(P<0.01)。單次取卵周期中，PGT-A組的累積妊娠率顯著降低，流產(chǎn)率顯著升高(P<0.05)。兩組累積活產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。PGT-A組和PGT-M組分別有26例和12例仍在繼續(xù)妊娠中。

表1 PGT-A組與PGT-M組基礎(chǔ)情況比較(-±s)

表2 PGT-A組與PGT-M組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及妊娠結(jié)局比較(%)

二、普通易位組和羅氏易位組的一般資料、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和妊娠結(jié)局比較

1.總體比較：普通易位組納入829個(gè)周期，檢測(cè)胚胎3 600枚；羅氏易位組納入357個(gè)周期，共檢測(cè)胚胎1 595枚。兩組在女方年齡、男方年齡、女方體重指數(shù)(BMI)、血清基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH和AMH水平方面，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 普通易位組與羅氏易位組基礎(chǔ)情況比較(-±s)

兩組卵裂率、D3胚胎形成率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與羅氏易位組相比較，普通易位組的囊胚形成率顯著降低，染色體異常率和胚胎異常率顯著升高(P<0.01)，HCG陽(yáng)性率和累積妊娠率均顯著降低(P均<0.05)。單次取卵周期，兩組妊娠結(jié)局的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。普通易位組和羅氏易位組分別有53例和22例仍在繼續(xù)妊娠中。

表4 普通易位組與羅氏易位組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及妊娠結(jié)局比較(%)

2.易位發(fā)生性別亞組比較：A組納入387個(gè)周期、檢測(cè)胚胎1 698枚，B組納入442個(gè)周期、檢測(cè)胚胎1 902枚，C組納入145個(gè)周期、檢測(cè)胚胎669枚，D組納入212個(gè)周期、檢測(cè)胚胎926枚。A組與B組進(jìn)行比較、C組與D組進(jìn)行比較。在女方年齡、男方年齡、女方體重指數(shù)(BMI)、血清基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH和AMH水平方面，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表5)。與B組相比較，A組的卵裂率顯著降低(P<0.05)；與D組相比較，C組的D3胚胎形成率顯著降低(P<0.05)。其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表6)。

表5 易位發(fā)生性別亞組基礎(chǔ)情況比較(-±s)

表6 易位發(fā)生性別亞組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較(%)

三、低DFI組和高DFI組一般資料、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和妊娠結(jié)局比較

低DFI組納入890個(gè)周期、檢測(cè)3 669枚囊胚，高DFI組納入176個(gè)周期、檢測(cè)651枚囊胚。兩組在女方BMI、血清基礎(chǔ)FSH和基礎(chǔ)LH方面，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低DFI組的雙方年齡均低于高DFI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表7)。與高DFI組相比，低DFI組受精率顯著升高(P<0.05)，染色體異常率和胚胎異常率顯著降低(P<0.05，P<0.01)，兩組囊胚形成率、累積妊娠率、累積活產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表8)。

表7 低DFI組與高DFI組基礎(chǔ)情況比較(-±s)

表8 低DFI組與高DFI組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及妊娠結(jié)局比較(%)

四、DFI和異常率的偏相關(guān)性分析

線性相關(guān)分析表明，DFI與染色體異常率、胚胎異常率之間有正相關(guān)關(guān)系(r=0.109，P<0.01；r=0.063，P<0.05)。男方年齡與DFI之間有正相關(guān)關(guān)系(r=0.133，P<0.01)。采用偏相關(guān)分析，控制雙方年齡變量，分析DFI與染色體異常率呈正相關(guān)(r=0.105，P<0.01)，與胚胎異常率不相關(guān)(r=0.057，P>0.05)(表9)。

表9 精子DFI與異常率的偏相關(guān)分析

討 論

生殖細(xì)胞染色體發(fā)生的隨機(jī)錯(cuò)誤導(dǎo)致散發(fā)的自然流產(chǎn)標(biāo)本中有50%～70%表現(xiàn)出某種細(xì)胞遺傳異常，最常見(jiàn)的核型是常染色體三體(60%)，X染色體單體(20%)和多倍體(20%)。無(wú)論夫婦雙方是否有反復(fù)妊娠丟失(RPL)病史，妊娠時(shí)均會(huì)受到這種錯(cuò)誤的影響[13]。本研究中選擇夫婦雙方染色體核型正常進(jìn)行單基因疾病診斷的PGT-M做對(duì)照組，其胚胎染色體仍有一定的異常率，證明了這一點(diǎn)。雙方年齡是配子及胚胎形成過(guò)程中非整倍體發(fā)生的重要影響因素。PGT-A組和PGT-M組的年齡等基礎(chǔ)情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PGT-A組的D3胚胎形成率和囊胚形成率低于PGT-M組，而染色體異常率和胚胎異常率顯著升高，可見(jiàn)有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)病史的夫婦更難獲得胚胎，且胚胎更容易發(fā)生染色體異常，證實(shí)了對(duì)反復(fù)妊娠丟失人群進(jìn)行非整倍體篩查的必要性。本研究中，PGT-A組和PGT-M組的夫婦均選擇整倍體胚胎移植，雖然累積活產(chǎn)率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但PGT-A組累積妊娠率仍較PGT-M組低，而流產(chǎn)率高，說(shuō)明除染色體異常因素外，RSA病史夫婦還受到其它流產(chǎn)危險(xiǎn)因素的影響，PGT-A對(duì)其妊娠結(jié)局的改善效果有限，這與之前的報(bào)道一致[14-17]。

普通相互易位攜帶者較羅氏易位攜帶者更難獲得胚胎，且胚胎染色體異常率更高，累積妊娠率更低。而兩組流產(chǎn)率、累積活產(chǎn)率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明PGT-SR能夠通過(guò)移植正常/平衡胚胎改善染色體異常因素導(dǎo)致的不良妊娠結(jié)局[18]。普通易位組和羅氏易位組分別表現(xiàn)出易位發(fā)生在女方時(shí)卵裂率和D3胚胎形成率更低，而其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和胚胎異常率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明卵母細(xì)胞染色體異?？赡苡绊懯芫研纬珊蟮脑缙谂咛グl(fā)育，而獲得正常胚胎的概率與易位發(fā)生在男方或女方無(wú)關(guān)[19]。

很大一部分精液正常的男性也表現(xiàn)出精子非整倍體增加，提示僅依靠常規(guī)精液參數(shù)無(wú)法鑒別出大部分處于精子非整倍體風(fēng)險(xiǎn)中的不育男性[12]。使用SCSA檢測(cè)精子DFI，其與精子總數(shù)、濃度、活力及前向運(yùn)動(dòng)百分率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[20-21]，在評(píng)估男性生育潛力方面更有臨床價(jià)值[9]。男方高齡對(duì)生殖結(jié)局有負(fù)面影響，包括延長(zhǎng)受孕時(shí)間、增加胚胎移植失敗率、影響活產(chǎn)結(jié)局等[22-23]，甚至與孩子的自閉癥、精神分裂癥及某些類型染色體病的發(fā)生相關(guān)[24-25]。并非總能觀察到所有的常規(guī)精液參數(shù)隨年齡增加同時(shí)出現(xiàn)負(fù)性變化[26-27]，而精子DNA碎片的增加對(duì)年齡具有依賴性[9，26，28-29]。本研究在選擇PGT助孕患者中也發(fā)現(xiàn)了DFI與男性年齡呈正相關(guān)，控制雙方年齡變量，分析DFI與染色體異常率仍呈正相關(guān)，而與胚胎異常率不相關(guān)。低DFI組與高DFI組的累積妊娠率及妊娠結(jié)局差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明精子DNA碎片的增加使異常胚胎的染色體組成更加混亂，但未顯著增加異常胚胎的數(shù)量，未達(dá)到影響更多胚胎的程度，可能與PGT均采取卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)的受精方式有關(guān)，這與一些關(guān)于精子DFI和IVF妊娠結(jié)局沒(méi)有相關(guān)性的研究結(jié)果相一致[30-32]。此外，高DFI組患者的納入人數(shù)較少也可能影響妊娠結(jié)局的分析，需要更大樣本量的研究。

本研究通過(guò)分析不同特征人群的PGT治療周期，探索復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史、染色體易位、精子DFI等影響胚胎染色體組成并可能預(yù)測(cè)臨床治療結(jié)局的因素，評(píng)估PGT對(duì)不同人群妊娠結(jié)局的益處，為理解胚胎染色體異常的發(fā)生提供思路，為高危人群相關(guān)臨床指標(biāo)的篩查及PGT的合理選擇提供依據(jù)。