朱奕騁

真核細(xì)胞基因組包含數(shù)十億個(gè)DNA 堿基，其編輯十分困難。對(duì)基因組進(jìn)行操作的技術(shù)突破之一，是通過(guò)同源重組（HR）進(jìn)行基因靶向的開(kāi)發(fā)。HR 介導(dǎo)的靶向技術(shù)通過(guò)操縱生殖系感受態(tài)干細(xì)胞，促進(jìn)了敲入和敲除動(dòng)物模型的產(chǎn)生，從而極大地推動(dòng)了生物學(xué)研究的許多領(lǐng)域的發(fā)展。

基于核酸酶的基因編輯技術(shù)十分有潛力。其中的CRISPR/Cas9 技術(shù)，幾乎可以靶向任何基因，且操作較為簡(jiǎn)便，敲除效率較高。本文簡(jiǎn)介了CRISPR/Cas9 技術(shù)的原理及其研究進(jìn)展，并討論了其在肺癌研究中的應(yīng)用。

1 CRISPR/Cas9 技術(shù)概述

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9）是一種較為新穎的基因編輯技術(shù)，在科研領(lǐng)域及醫(yī)療領(lǐng)域有著十分廣泛的應(yīng)用。

1.1 CRISPR/Cas9 技術(shù)的產(chǎn)生背景

CRISPR/Cas9 技術(shù)可能是基因編輯領(lǐng)域近10 年來(lái)最偉大的成果之一。1987 年，日本的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了微生物中的串聯(lián)間隔重復(fù)序列，但他們的報(bào)道并沒(méi)有引起科學(xué)界的重視。

2002 年，Jansen 等這種序列其命名為CRISPR。此外，研究表明，局部DNA 雙鏈斷裂（DSB）可以觸發(fā)易出錯(cuò)的非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)途徑。這些早期的基因組編輯研究，讓DSB 誘導(dǎo)的HR 和NHEJ 成為真核生物基因組修飾的重要方法[1]。

2005 年，在科學(xué)家對(duì)分隔單個(gè)直接重復(fù)序列的間隔子序列進(jìn)行分析的時(shí)候，他們發(fā)現(xiàn)，這些序列可能與噬菌體相關(guān)。他們推測(cè)，CRISPR 可能與微生物的免疫記憶和防御機(jī)制相關(guān)，不過(guò)，科學(xué)家仍未弄清，間隔子是如何發(fā)揮作用的。他們提出了一些假設(shè)，認(rèn)為CRISPR 間隔子可能充當(dāng)小RNA 向?qū)?，以降解的病毒轉(zhuǎn)錄物[2]。

2008 年，科學(xué)家又發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR 系統(tǒng)能阻止外源DNA 的入侵，并驗(yàn)證了其功能[3]。

可以說(shuō)，CRISPR 的發(fā)展主要經(jīng)歷了以下階段（圖1）：

圖1 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)的發(fā)展階段

1.2 CRISPR 系統(tǒng)

CRISPR 系統(tǒng)包括一系列Cas 蛋白，這些蛋白可以協(xié)助CRISPR 系統(tǒng)，使其更好地發(fā)揮免疫作用。在噬菌體入侵細(xì)菌時(shí)，Cas 蛋白將其識(shí)別，并整合到宿主的基因組上。在噬菌體第二次入侵時(shí)，CRISPR系統(tǒng)可以準(zhǔn)確地識(shí)別外源噬菌體，并利用Cas 蛋白的內(nèi)切酶活性切斷其DNA，使外源噬菌體失去毒力（圖2）。

圖2 CRISPR-Cas9技術(shù)的操作示意圖

1.3 CRISPR/Cas9 技術(shù)的應(yīng)用

利用基因工程技術(shù)，我們可以改變細(xì)胞的遺傳和表觀遺傳特征，從而開(kāi)展基礎(chǔ)生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究。利用基因編輯技術(shù)，我們可以在動(dòng)物或細(xì)胞模型中快速有效地誘導(dǎo)變異，從而改變其動(dòng)物或細(xì)胞的功能?；蚓庉嬕矔?huì)促進(jìn)有用的合成材料的生產(chǎn)，例如，硅基硅藻可以用于遞送口服藥物。此外，對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行精確的基因編輯，可以提高其或病原體感染的抗性，提高食品的安全性。在醫(yī)藥領(lǐng)域，基因編輯可以彌補(bǔ)體細(xì)胞中的遺傳或表觀遺傳缺陷，根治遺傳病，這就是基因手術(shù)。最后，運(yùn)用基因編輯技術(shù)改造細(xì)胞，可以讓細(xì)菌高效地生產(chǎn)藥物前體，顯著降低治療的成本[4]。

CRISPR/Cas9 技術(shù)在腫瘤的治療中扮演著重要的角色。與其他腫瘤相比，肺癌的發(fā)病率和死亡率十分驚人。利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，我們可以研究某些基因在肺癌的發(fā)生中的作用（圖3），助力肺癌的診斷與治療。

圖3 CRISPR/Cas9技術(shù)治療肺癌的流程圖

2 CRISPR/Cas9 技術(shù)的原理

CRISPR/Cas9 技術(shù)的基本原理是，改造天然的Cas 蛋白，從而構(gòu)建一個(gè)更穩(wěn)定的核酸內(nèi)切酶，讓它在特定位置切斷雙鏈DNA，在DNA的修復(fù)的過(guò)程中，基因會(huì)發(fā)生突變，利用這個(gè)過(guò)程，科學(xué)家可以對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)改造。

在運(yùn)用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行編輯時(shí)，必須首先將Cas9 核酸酶蛋白和gRNA 輸送到靶細(xì)胞中。這通常是通過(guò)向受體細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)DNA 的質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但我們也可以通過(guò)遞送RNA 達(dá)到這一目的。gRNA 會(huì)將Cas9 引導(dǎo)至與gRNA 中的“間隔”序列匹配的靶DNA“原間隔子”序列處[5]。在原間隔子的旁邊，通常存在一段原間隔物相鄰基序（PAM），對(duì)于最常用的Cas9 蛋白，這段序列為NGG。如果間隔子和原間隔子相同，或在間隔子的5'末端僅有幾個(gè)錯(cuò)配，Cas9 將切割兩條DNA 鏈，造成雙鏈斷裂（圖4）。

圖4 CRISPR/Cas9技術(shù)的原理

3 CRISPR/Cas9 技術(shù)的研究進(jìn)展

CRISPR 系統(tǒng)由sgRNA 和Cas 蛋白組成。在sgRNA 的指導(dǎo)下，Cas 蛋白定位到基因組的目標(biāo)位置，從而實(shí)現(xiàn)精確的遺傳修飾。修復(fù)DSB 的DNA 修復(fù)機(jī)制有兩種高度保守的途徑：NHEJ 和HR。NHEJ 是易于出錯(cuò)的修復(fù)機(jī)制，因?yàn)樾迯?fù)后的DNA 通常在靶位點(diǎn)周圍有一個(gè)小的插入缺失，從而導(dǎo)致基因破壞。因此，我們通常利用NHEJ 使致病基因失活，改變其表達(dá)水平。相反，HR 是一種特定的DNA 修復(fù)機(jī)制，在存在修復(fù)模板的情況下，HR 將糾正基因突變或幫助我們插入合成序列。目前，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已用于基因敲除、基因突變、轉(zhuǎn)錄激活和基因篩選等[6]。

許多科學(xué)家致力于對(duì)脫靶效應(yīng)的研究，他們嘗試改進(jìn)Cas9，從而減少脫靶事件的發(fā)生。一些研究人員發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生單鏈斷裂（SSB）可能是一種有效的方式。由于DNA 單鏈斷裂是通過(guò)高保真堿基切除修復(fù)（BER）途徑修復(fù)的，Cas9 切口酶可用于更特異性的NHEJ 和HR。

為了提高靶標(biāo)DSB 的特異性，可以使用類似于二聚ZFN 或TALEN 的雙切口法，來(lái)增加在靶DNA 中特異性識(shí)別的堿基總數(shù)。除雙切口策略外，被人為截短的sgRNA，也會(huì)顯著提高SpCas9 的靶向特異性，這可能是因?yàn)樗鼈儗?duì)錯(cuò)配更加敏感。我們可以在使用多重切口策略的同時(shí)應(yīng)用這些截短的sgRNA，以進(jìn)一步降低脫靶的概率。

4 CRISPR/Cas9 技術(shù)在肺癌研究中的應(yīng)用

在過(guò)去的幾十年中，基因療法是癌癥研究中最熱門的領(lǐng)域之一。這是因?yàn)?，癌癥的發(fā)生與進(jìn)展，與遺傳有著密切的關(guān)系。與傳統(tǒng)的治療方法相比，基因療法可以更徹底地治療癌癥，而且其副作用很小。使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)內(nèi)源基因座進(jìn)行靶向修飾，可以克服傳統(tǒng)方法的局限性。這一技術(shù)的不斷成熟，使研究人員能夠進(jìn)一步探索癌癥研究中的未知領(lǐng)域，為無(wú)數(shù)腫瘤患者帶來(lái)了福音。

4.1 CRISPR/Cas9 技術(shù)在構(gòu)建肺癌動(dòng)物模型中的應(yīng)用

構(gòu)建肺癌動(dòng)物模型一直是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，與CRISPR 相關(guān)的新技術(shù)浪潮，使研究人員能夠構(gòu)建更多滿足研究需要的動(dòng)物模型。將一些抑癌基因敲除，可能有助于構(gòu)建在功能和結(jié)構(gòu)上類似于天然腫瘤的肺癌動(dòng)物模型。利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，可以高效地敲除感興趣的基因，從而構(gòu)建相關(guān)的動(dòng)物模型。一些科學(xué)家應(yīng)用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除了3 種主要的腫瘤抑制基因TRP53、PTEN 和VHL，成功地構(gòu)建了肺癌模型。在對(duì)某些肺癌相關(guān)基因的研究過(guò)程中，我們也可以將CRISPR/Cas9 技術(shù)與其他基因編輯技術(shù)結(jié)合使用[7]。

4.2 CRISPR/Cas9 技術(shù)在肺癌治療中的應(yīng)用

迄今為止，全世界有13 項(xiàng)將CRISPR 作為癌癥治療的干預(yù)手段的臨床試驗(yàn)（來(lái)源：clinicaltrials.gov）。在離體基因編輯研究中，可以通過(guò)敲除T 淋巴細(xì)胞中某些降低其靶向效率的基因，來(lái)提高T 細(xì)胞的有效性；也可以將癌細(xì)胞抗原特異的嵌合抗原受體連接到T 淋巴細(xì)胞表面，以增加其靶向特異性，從而提高其靶向效率。

到目前為止，CRISPR/Cas9 技術(shù)作為肺癌的干預(yù)手段，僅在一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中得以實(shí)施。該試驗(yàn)?zāi)壳罢谒拇ù髮W(xué)進(jìn)行。在這項(xiàng)試驗(yàn)中，研究人員評(píng)估PD-1 基因敲除的T 細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌的安全性（試驗(yàn)編號(hào)：NCT02793856）。這項(xiàng)研究的基礎(chǔ)是PD-1 基因的功能，PD-1 基因是一種促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡的基因，已被證明僅在活化的T 細(xì)胞中表達(dá)，并作為免疫檢查點(diǎn)。因此，敲除PD-1基因?qū)⒀娱L(zhǎng)T 細(xì)胞的壽命，并通過(guò)破壞T 細(xì)胞周期檢查點(diǎn)抑制劑來(lái)防止活化的T 細(xì)胞死亡。這將增加血液中活化的T 細(xì)胞計(jì)數(shù)，從而抑制腫瘤的進(jìn)展。在上述研究中，研究人員從外周血中收集自體來(lái)源的T 細(xì)胞，并使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)特異性地敲除PD-1 基因。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)后，研究人員將進(jìn)一步擴(kuò)增并選擇自體來(lái)源的PD-1 基因敲除的T 淋巴細(xì)胞。將這些T 細(xì)胞分批回輸體內(nèi)后，研究人員將評(píng)估治療效果[8]。

5 結(jié)語(yǔ)

基于基因療法的技術(shù)有可能在癌癥研究中帶來(lái)突破，而CRISPR 是一種非常有針對(duì)性和有效的工具，有潛力將其轉(zhuǎn)化為可用的療法。事實(shí)證明，與ZFN 和TALENs 等其他著名的基因治療技術(shù)相比，CRISPR 具有許多優(yōu)勢(shì)。雖然現(xiàn)在可用的其他治療方法只是暫時(shí)的，隨著時(shí)間的流逝會(huì)逐漸消失，但是基因治療是遺傳的，可以永久使用，就像將治療方法硬編碼到體內(nèi)一樣。這具有創(chuàng)造疫苗和永久治愈的潛力。除治療方面的應(yīng)用外，CRISPR 也是了解我們細(xì)胞中代謝反應(yīng)及信號(hào)通路的一種重要工具。我們應(yīng)當(dāng)充分利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，更深入地研究與肺癌相關(guān)基因的功能，助力腫瘤治療學(xué)的發(fā)展。