（青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海西寧 810008）

硒是維持人體和動物正常生長和發(fā)育的重要微量元素之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗氧化等多種生物活性[1]。硒的生物學(xué)功能取決于其化學(xué)形態(tài)，作為膳食補充物的有機硒化合物，與無機硒相比，具有吸收利用率高、營養(yǎng)價值高、更健康和安全等優(yōu)點。大量研究發(fā)現(xiàn)，酵母、細(xì)菌和真菌等微生物能富集大量硒并將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒[2-4]。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，富硒蕈菌中硒的主要賦存形態(tài)為硒蛋白、硒核酸和硒多糖[5-6]。從蕈菌富硒培養(yǎng)物中提取得到的硒多糖，經(jīng)證實具有一定的抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[7-9]。因此，硒多糖可作為很好的補硒劑并應(yīng)用于藥品或高附加值的食品中。

黃綠蜜環(huán)菌（Armillaria luteo-virens）是一種重要的高原特色蕈菌資源，目前還難以實現(xiàn)人工栽培。一些研究者關(guān)注黃綠蜜環(huán)菌液體培養(yǎng)產(chǎn)生的菌絲體或發(fā)酵液中的代謝產(chǎn)物的成分以及生物活性的研究[10-12]，基于硒對液體培養(yǎng)黃綠蜜環(huán)菌生長存在一定的作用[13]，探討黃綠蜜環(huán)菌富硒培養(yǎng)后產(chǎn)生的胞外多糖的抗氧化活性和抑菌活性，旨在為尋找生產(chǎn)硒源的適當(dāng)途徑提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黃綠蜜環(huán)菌菌株由青海師范大學(xué)微生物實驗室提供。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）：廣東微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基配方為去皮馬鈴薯200g、一水葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；液體種子培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200 g、一水葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL；發(fā)酵培養(yǎng)基配方為蔗糖40 g、牛肉膏1 g、KH2PO41 g、MgSO41 g、蒸餾水 1 000 mL。

細(xì)菌培養(yǎng)基：細(xì)菌固體培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，配方為牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂 15 g、蒸餾水 1 000 mL、pH 7.2～7.4（用 1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值）；細(xì)菌液體培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，配方為牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2～7.4（用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值）。

1.1.3 試劑與儀器設(shè)備

一水葡萄糖（分析純）：煙臺市雙雙化工有限公司；蔗糖（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨（生物試劑）、牛肉膏（生物試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；KH2PO4（分析純）、NaOH（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；MgSO4（分析純）：上海廣諾化學(xué)科技有限公司；NaCl（分析純）：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；蒽酮（分析純）：上海展云化工有限公司；抗壞血酸（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

LS-35HD型立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；250B型生化培養(yǎng)箱、V-5100紫外分光光度計：金壇市富華儀器有限公司；CJ-LS型凈化工作臺：天津市泰斯特儀器有限公司；TD5A臺式低速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；SHA-C型水浴恒溫振蕩器：金壇市天競實驗儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 黃綠蜜環(huán)菌菌株富硒培養(yǎng)

將3塊4 mm直徑的黃綠蜜環(huán)菌菌塊接種于種子培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶中裝入100 mL培養(yǎng)液，于25℃培養(yǎng)4 d，所獲培養(yǎng)液作為液體菌種。以15%的接種量將液體菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25℃下培養(yǎng)4 d時加入100 μL的800 mmol/L亞硒酸鈉，使發(fā)酵培養(yǎng)基硒濃度為0.80 mmol/L，置于25℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至8 d。

1.2.2 黃綠蜜環(huán)菌硒多糖的提取與純化

發(fā)酵產(chǎn)物以4 000 r/min離心10 min，得到菌絲體和發(fā)酵液。發(fā)酵液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50℃減壓濃縮至原體積的20%左右，加3倍體積95%乙醇，放入4℃冰箱中醇析24 h，得絮狀沉淀，95%乙醇洗滌兩次，Sevag法（氯仿∶正丁醇4∶1，體積比）脫蛋白后，45℃條件下干燥得胞外硒多糖。

1.2.3 黃綠蜜環(huán)菌硒多糖中硒含量和多糖的測定

根據(jù)GB5009.93-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測定》[14]（第一法），依托廣東東方縱橫檢測有限公司對硒多糖中硒含量進(jìn)行檢測；采用蒽酮-硫酸法[15]測定多糖的含量。

1.2.4 清除羥基自由基

吸取2 mL濃度為9 mmol/L FeSO4溶液與2 mL濃度為9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、2 mL不同濃度的樣品溶液（2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL）及 2 mL的8.8 mmol/L H2O2混合，置于37℃水浴30 min，冷卻至25℃室溫后在510 nm波長處測定吸光度（用蒸餾水調(diào)零）[16]，不同濃度的抗壞血酸溶液作為對照。羥基自由基清除率計算公式為：羥基自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100。

式中：A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度；A1為樣品反應(yīng)后的吸光度；A2為樣品溶液和蒸餾水代替H2O2的吸光度。

1.2.5 清除DPPH自由基

吸取2.5 mL DPPH乙醇溶液（40.00 mg/L）與0.5 mL 不同濃度的樣品溶液（2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL）混勻，于37℃的恒溫水浴下避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測定混合液的吸光度（用無水乙醇調(diào)零），以抗壞血酸作為對照[17]。DPPH自由基清除率計算公式為：DPPH自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100。

式中：A0為2.5 mL DPPH和0.5 mL無水乙醇溶液的吸光度；A1為2.5 mL DPPH和0.5 mL樣品溶液的吸光度；A2為2.5 mL無水乙醇和0.5 mL樣品溶液的吸光度。

1.2.6 清除ABTS+自由基

取0.2 mL 7.40 mmol/L ABTS溶液與0.2 mL 2.60 mmol/L過硫酸鉀溶液混勻，在黑暗、25℃室溫條件下放置12h后，用無水乙醇稀釋40倍～50倍，以734nm波長處測得的吸光度（0.7±0.02）為宜。再取4 mL上述混合液與 1 mL不同濃度樣品溶液（2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL）混合，振搖 10 s，靜置 6 min，在734 nm波長處測定混合液的吸光度[18]。ABTS+自由基清除率計算公式為：ABTS+自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100。

式中：A0為4 mL混合液和1 mL無水乙醇的吸光度；A1為4 mL混合液和1 mL樣品溶液的吸光度；A2為4 mL無水乙醇和1 mL樣品溶液的吸光度。

1.2.7 硒多糖對細(xì)菌的抑菌效果

分別將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)18 h～24 h，采用血球計數(shù)板法檢測細(xì)菌濃度，制備106cfu/mL細(xì)菌懸浮液。

采用濾紙片擴散法（濾紙片直徑6 mm）測定濃度為 2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL 硒多糖或亞硒酸鈉對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用。在無菌培養(yǎng)皿中倒入適量牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，待其冷卻，加入0.10 mL供試菌液，涂布均勻，制成含菌平板，將無菌的濾紙片放入平板中央，吸取不同濃度的硒多糖或亞硒酸鈉溶液10 μL滴在滅菌的濾紙片上，將處理好的平板置于37℃培養(yǎng)24 h后觀察濾紙片周圍抑菌圈的大小，并測量其直徑。0.04%和0.06%鏈霉素作為陽性對照，陰性對照為無菌水，每個處理重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各項測定指標(biāo)通過SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（LSD，P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃綠蜜環(huán)菌硒多糖中硒和多糖的含量

黃綠蜜環(huán)菌硒多糖中硒含量為（2.84±0.23）g/kg，多糖含量為（56.27±0.35）%。

2.2 黃綠蜜環(huán)菌硒多糖的抗氧化活性

2.2.1 黃綠蜜環(huán)菌硒多糖對羥基自由基的清除能力

不同濃度的黃綠蜜環(huán)菌硒多糖或抗壞血酸對羥基自由基的清除效果見圖1。

濃度為2.50 mg/mL～12.50 mg/mL的抗壞血酸對羥基自由基的清除能力相對較高，達(dá)到96.43%～98.84%；黃綠蜜環(huán)菌硒多糖對羥基自由基清除能力隨著濃度的升高清除率顯著地增加（P＜0.05），但在相同濃度下硒多糖的清除率均低于抗壞血酸。

2.2.2 黃綠蜜環(huán)菌硒多糖對DPPH自由基的清除能力

圖 2 表示濃度為 2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mg/mL黃綠蜜環(huán)菌硒多糖或抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力。

圖2 黃綠蜜環(huán)菌硒多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.2 DPPH radical activity of selenium-containing exopolysaccharide extracted from A.luteo-virens

抗壞血酸在測試濃度下對DPPH清除率達(dá)到96%～97%；而硒多糖清除DPPH自由基的能力隨著濃度的升高而顯著上升（P＜0.05），其清除DPPH自由基的效果低于抗壞血酸。

2.2.3 黃綠蜜環(huán)菌硒多糖對ABTS+自由基的清除能力

不同濃度的黃綠蜜環(huán)菌硒多糖和抗壞血酸對ABTS+自由基有較高的清除效果見圖3。

圖3 黃綠蜜環(huán)菌硒多糖對ABTS+自由基的清除作用Fig.3 ABTS+radical activity at different of selenium-containing exopolysaccharide extracted from A.luteo-virens

濃度為2.50 mg/mL～12.50 mg/mL抗壞血酸清除效果較穩(wěn)定，而硒多糖清除ABTS+自由基的能力隨濃度的增加呈現(xiàn)顯著地上升趨勢（P＜0.05），但硒多糖的清除效果不如抗壞血酸。

2.3 黃綠蜜環(huán)菌硒多糖對細(xì)菌的抑菌效果

黃綠蜜環(huán)菌硒多糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑見表1。

表1 黃綠蜜環(huán)菌硒多糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑Table 1 The inhibition zones of selenium-containing polysaccharide extracted from A.luteo-virens against S.aureus and E.coli

由表1結(jié)果可知，相同濃度下黃綠蜜環(huán)菌硒多糖抑菌效果低于亞硒酸鈉。所測試濃度的黃綠蜜環(huán)菌硒多糖對金黃色葡萄球菌沒有抑菌效果，對大腸桿菌的抑菌效果較明顯；且濃度為7.50 mg/mL～10.00 mg/mL硒多糖對大腸桿菌的抑菌效果顯著高于2.50 mg/mL～5.00 mg/mL的硒多糖（P＜0.05）。不同濃度的亞硒酸鈉對大腸桿菌抑菌效果也存在顯著性差異（P＜0.05），但濃度達(dá)到10.00 mg/mL～12.50 mg/mL的亞硒酸鈉才能抑制金黃色葡萄球菌的生長。

3 討論與結(jié)論

許多蕈菌作為硒的載體，使硒與多糖組分結(jié)合形成硒多糖[4-7]，靈芝在亞硒酸鈉濃度為 100、200、250 μg/kg的基質(zhì)上生長，獲得3種硒多糖中多糖含量依次為85.9%、86.3%、87.1%，而硒含量分別為 20.53、49.62、60.50 μg/g[7]。本研究中利用黃綠蜜環(huán)菌在0.8 mmol/L亞硒酸鈉濃度下培養(yǎng)獲得的胞外硒多糖中硒的含量為（2.84±0.23）g/kg，多糖含量為（56.27±0.35）%，由此說明富硒培養(yǎng)時菌種不同、加入無機硒的濃度不同，提取出的硒多糖的硒含量也會存在差異，而多糖含量相對恒定。

通過體外抗氧化活性測定，從富硒蕈菌中獲得的硒多糖對羥基自由基、DPPH自由基、ABTS+自由基清除能力高于不加硒得到的多糖，說明了硒在抗氧化能力方面起到關(guān)鍵性作用[7-8]，隨著硒多糖濃度的增加其抗氧化活性增強，但清除自由基的能力仍不如抗壞血酸[8]。本研究結(jié)果也證實黃綠蜜環(huán)菌硒多糖抗氧化活性與其濃度密切相關(guān)。

蕈菌液體培養(yǎng)產(chǎn)生的多糖物質(zhì)除了具有抗氧化活性外，還對細(xì)菌、真菌等微生物具有抑制作用[19-20]。以豬苓多糖和亞硒酸鈉為原料，采用化學(xué)合成法制備豬苓硒多糖，豬苓硒多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母和黑曲霉的抑制效果強于豬苓多糖[21]。可見，硒能提高多糖的抑菌能力。本試驗發(fā)現(xiàn)黃綠蜜環(huán)菌硒多糖對大腸桿菌的抑菌效果明顯，而對金黃色葡萄球菌沒有抑菌效果（表1）。黃綠蜜環(huán)菌富硒培養(yǎng)后獲得的胞外硒多糖，體外測試具有一定的清除自由基能力和抑制細(xì)菌生長的活性，而有關(guān)黃綠蜜環(huán)菌硒多糖動物試驗功能特性的表現(xiàn)以及應(yīng)用于食品中發(fā)揮的功能作用還有待進(jìn)一步的研究。