滕安國，李冰馨，趙靜怡，李雪濤，張芹

（天津科技大學食品科學與工程學院，天津300457）

肉的保水性（water-holding capacity，WHC）是評價肉制品品質(zhì)的重要指標之一，直接影響著肉的滋味、香氣、多汁性、營養(yǎng)成分、嫩度以及顏色等食用品質(zhì)[1]。鹽溶蛋白是影響肉制品品質(zhì)特性的主要肌肉蛋白質(zhì)，鹽溶蛋白擁有特殊的化學結(jié)構(gòu)，電荷之間的相互作用力可使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，熱誘導凝膠形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，從而提高肉制品的品質(zhì)，增加保水效果[2]。

磷酸鹽作為水分保持劑[3]，在熟肉制品和預制肉制品加工時，常用磷酸鹽有焦磷酸鈉（sodium pyrophosphate，SPP）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STP）和六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate，SHP）[4-7]，磷酸鹽也有一定的酸度調(diào)節(jié)劑作用[8]。磷酸鹽能改變肌原纖維蛋白的熱誘導凝膠流變特性[9]，提高鹽溶蛋白質(zhì)凝膠保持水分和脂肪的能力，減少營養(yǎng)成分的損失，從而影響肉制品保水性、成品率[10]。但是，長期食用過多含磷酸鹽類食品，會降低人體對鈣的吸收，導致機體鈣磷失衡[11]，甚至會導致某些家族遺傳性疾病及慢性腎病患者發(fā)生血管鈣化[12]。近年來，無磷保水劑成為研究熱點。張杰等[13]研究檸檬酸三鈉等無磷保水劑對牦牛肉糜保水性發(fā)現(xiàn)，添加1.20%檸檬酸三鈉時蒸煮損失和離心損失最小。檸檬酸鈉（sodium citrate，SC）作為無磷保水劑作用在海產(chǎn)品上，得出最優(yōu)組合為氯化鈉0.5%、SC 1.8%、海藻糖0.5%，蒸煮損失率從50.06%降至39.11%，WHC從3.70%提高至6.03%[14]。SC作為食品、飲料工業(yè)中的調(diào)味劑、乳化劑、膨脹劑、穩(wěn)定劑等被廣泛應用[15-16]。在肉制品加工上，檸檬酸鹽作為酸度調(diào)節(jié)劑可適量使用[8]。

然而，在食品工業(yè)上，完全替代磷酸鹽的保水作用，尚有一定難度。本研究從水分保持劑的實際應用角度出發(fā)，并綜合考慮消費者對食品健康的需求，以檸檬酸鹽逐步替代磷酸鹽為目的。本研究在SPP、STP和SHP 3種水分保持劑的基礎(chǔ)上，加入酸度調(diào)節(jié)劑SC，研究復合鹽對牛肉凝膠的保水性，并將鹽溶蛋白液進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），分析凝膠保水性與鹽溶蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。檸檬酸鹽協(xié)同磷酸鹽保水作用的研究有著現(xiàn)實意義，不僅能夠減少磷酸鹽的過量添加，而且能提高肉的離子強度、提高pH值[17]、螯合金屬離子[18]，從而改善肉品品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛背長?。菏惺劾漉r肉；SPP、STP、SHP、SC 均為食品級：天津大學科威公司。

TQ-5型絞肉機：廣東恒聯(lián)食品機械有限公司；XHF-D型高速組織勻漿機：寧波新芝生物科技股份有限公司；G10型離心機：白洋離心機廠；PB-21型酸度計、BSA224S-CW型分析天平：德國Sartorius公司；XMTD-204型恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器儀表有限公司；DFG80-1型電熱鼓風干燥箱：湖北黃石市醫(yī)療器械廠；JY-SCZ2型電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；ChemiDocXRS型凝膠成像儀：Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 鹽溶蛋白的制備

牛肉剔除結(jié)締組織置于絞肉機中打成肉糜，稱取20 g肉糜，加入0.6 mol/L NaCl溶液80 mL，用高速組織勻漿機進行勻漿處理（4℃，8 000 r/min，30 min），勻漿液在4℃條件下靜止放置24 h；雙層紗布過濾，粗濾液經(jīng)4 000 r/min離心5 min后，所得上清液即為鹽溶蛋白溶液[19-20]。

1.2.2 鹽溶蛋白凝膠的制備及試驗設(shè)計

取鹽溶蛋白溶液稱重，分別按質(zhì)量分數(shù)加入SPP、STP、SHP和SC，溶于離心管中充分混勻后加熱，從30℃緩慢升溫到70℃，升溫速率為1℃/min，70℃恒溫保持5 min，形成的凝膠用自來水冷卻至25℃。

1.2.2.1 單因素試驗設(shè)計

在制備蛋白凝膠后添加4組鹽，分別為SPP、STP、SHP和SC，每組按質(zhì)量分數(shù)0.05%、0.1%、0.15%、0.2%和0.25%梯度添加，每個梯度重復3次，進行鹽溶蛋白pH值測定和凝膠保水性測定。

1.2.2.2 正交試驗設(shè)計

SPP、STP、SHP和SC組成復合鹽，試驗共4個因素，以單因素試驗得到每種鹽最適添加量為基礎(chǔ)，設(shè)3個水平，通過L9（34）正交試驗表設(shè)計9組試驗（n=3），通過試驗結(jié)果、R和極值，進行正交試驗綜合分析，得出最優(yōu)組合。

1.2.3 凝膠保水性的測定

將制備的鹽溶蛋白凝膠3 000 r/min離心5 min后稱量，將已離心樣品中的水分用濾紙吸干，再稱重。每個處理測定3個重復，4℃條件下保存待測。牛肉凝膠保水性按照公式（1）計算。

式中：m、m1、m2分別為離心管質(zhì)量、離心管和離心后凝膠質(zhì)量、離心管和離心前凝膠質(zhì)量，單位均為g。

1.2.4 鹽溶蛋白凝膠的SDS-PAGE分析

將提取的鹽溶蛋白溶液進行SDS-PAGE電泳，試驗所采用的濃縮膠和分離膠的濃度分別為3%和10%。將鹽溶蛋白質(zhì)溶液濃度稀釋到1 mg/mL，上樣量為 10 μL[21]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，使用CompareMeans下One-WayANOVA進行標準差分析和顯著性檢驗。試驗結(jié)果以平均值±標準差表示，每組n=3。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一鹽的保水性

按照食品添加劑使用GB2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》的用量規(guī)定，復合磷酸鹽使用時以磷酸鹽計，不得超過5 g/kg。不同磷酸鹽及檸檬酸鹽添加量對鹽溶蛋白溶液pH值的影響見圖1，單一鹽的不同添加量對鹽溶蛋白凝膠保水性的影響見圖2。

圖1 磷酸鹽及檸檬酸鹽對鹽溶蛋白溶液pH值的影響Fig.1 Effect of phosphate on pH value of salt soluble protein solution

肌球蛋白的等電點在5.0左右，從圖1可以看出，加入磷酸鹽和檸檬酸鹽均可以使鹽溶蛋白的pH值升高，且表現(xiàn)為濃度依賴性，但在鹽濃度達到0.25%時，添加STP、SHP和SC的鹽溶蛋白的pH值均有所降低。鹽溶蛋白的pH值升高，偏離肌球蛋白等電點，使得凝膠過程中蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用增強，形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過試驗前期測得（見表1），1%的SPP水溶液pH值為10.0～10.2；1%的STP水溶液pH值為9.3左右，均為堿性，可以提高鹽溶蛋白凝膠的保水性，并隨著加熱pH值不發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）。

圖2 磷酸鹽及檸檬酸鹽對鹽溶蛋白凝膠保水性的影響Fig.2 Effect of phosphate on water holding capacity of salt soluble protein gel

從圖2可知，在牛肉中添加磷酸鹽可增加鹽溶蛋白凝膠的保水性。SPP在添加量為0.2%時達到最大值，而后由于凝膠均一性變差[22]，導致WHC下降；隨著STP添加量的增加，WHC逐漸增加，最適添加量為0.15%；SHP的添加量在0.1%之后隨著百分比的增加WHC小幅度的增加，最適添加量為0.15%。

表1 不同加熱溫度條件下1%磷酸鹽溶液pH值Table 1 pH value of 1%phosphate solution at different heating temperature

SC是目前最重要的檸檬酸鹽，其安全無毒，作為食品添加劑廣泛使用[23]。SC屬于弱酸強堿鹽，其水溶液顯堿性，具有良好的pH值緩沖性能。SC可以提高肉的pH值，因而能夠阻止因pH值降低而引起的肉保水性問題。

由圖2可知，隨著SC添加量的增加，鹽溶蛋白凝膠保水性提高，圖1表明SC可以提高pH值，故可使肌球蛋白pH值偏離等電點，從而使凝膠保水性增強。Kuwahara等[24]的研究結(jié)果與本研究相似，SC可以抑制魷魚肌肉蛋白質(zhì)的自溶活性，從而改進魷魚的蛋白凝膠性能。同時，SC在結(jié)構(gòu)上與多聚磷酸鹽類似，具有多個離子結(jié)合點，能夠增加肉中各種蛋白的電荷，使其蛋白間相斥，產(chǎn)生更多容納水的空間。SC作為品質(zhì)改良劑對魷魚外套膜肌肉蛋白凝膠的強度、保水性存在著顯著性關(guān)系[25]。因此，SC可作為一種理想的保水劑。

2.2 檸檬酸鹽與磷酸鹽最佳配比的測定

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇 SPP（A）、STP（B）、SHP（C）和SC（D）的最適添加量為因素進行正交試驗。結(jié)果見表2。

表2 檸檬酸鹽與磷酸鹽的正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test for citrate and phosphate

續(xù)表2 檸檬酸鹽與磷酸鹽的正交試驗因素水平表Continue table 2 Factors and levels of orthogonal test for citrate and phosphate

由表2可知，第1號試驗的pH值為5.69最大，但是與第6、9號試驗結(jié)果5.68差別不大，通過極值分析得出pH值較優(yōu)組合為A2B3C3D1。從表2可以看出，第6號試驗的WHC為93.98%，試驗結(jié)果較好，其因素組合為A2B3C2D1。根據(jù)R值，影響牛肉鹽溶蛋白凝膠保水性的主次因素為：A＞B＞C＞D，即SPP對凝膠保水性影響最大，其次是STP、SHP，SC對凝膠保水性影響相對較小。從極值分析得出WHC較優(yōu)組合為A2B3C3D1，即SPP、STP、SHP和SC 的質(zhì)量配比為 2∶2∶2∶3，與較好組合不一致。由于較優(yōu)組合不在正交試驗的9次試驗中，因此需要進一步驗證試驗。李躍文[26]使用復合磷酸鹽改良鴨肉加工品質(zhì)，SPP∶STP∶SHP最佳配方為5∶4∶4，與本研究所得配方中接近，SC和SPP水溶液都呈堿性，添加SC可以使SPP用量降低。

2.3 最佳配比驗證試驗

通過pH值和WHC的極值分析，同時得到較優(yōu)組合為 SPP∶STP∶SHP∶SC 的質(zhì)量配比為 2∶2∶2∶3，可見pH值與WHC有較強的關(guān)聯(lián)，因此，下文研究只考慮WHC。按比例稱取4種鹽充分混勻成復合鹽，在此條件下進行驗證試驗（n=3），添加0.5%復合鹽到鹽溶蛋白溶液中，制備凝膠。通過試驗WHC為（94.03±0.32）%，均高于正交試驗的9組結(jié)果，表明該較優(yōu)組合為最佳配比。

2.4 復合鹽最佳添加量的確定

根據(jù)GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》的用量規(guī)定，本文對添加量大于0.5%的情況不做研究。復合鹽添加量對牛肉凝膠保水性的影響見表3。

由表3可以看出，隨著復合鹽添加量的增加，鹽溶蛋白凝膠保水性顯著性增加（P＜0.05），當添加量達到0.4%～0.5%時，WHC值趨于穩(wěn)定，而低于0.2%，凝膠的保水性相對較低。

表3 復合鹽對鹽溶蛋白凝膠保水性的影響Table 3 The effect of compound salt on water holding capacity of salt soluble protein gel

2.5 鹽溶蛋白凝膠的SDS-PAGE分析

為了研究凝膠保水性與形成凝膠的鹽溶蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，選取一組空白、單因素試驗中4種鹽最佳添加量，以及4種鹽的最佳配比復合鹽，共6組樣品，添加到牛肉鹽溶蛋白溶液中，進行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖3。

圖3 添加不同鹽類鹽溶蛋白凝膠SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE map of salt soluble protein gel

分子量在220 kDa處的是肌球蛋白重鏈[27]，通過SDS-PAGE圖看出，CP組的肌球蛋白鏈比其他組條帶濃度稍大，STP組在此處條帶濃度較低，說明經(jīng)過不同條件處理的鹽溶蛋白溶液的蛋白質(zhì)組分有一定差異。由圖3可知，在97.4 kDa～31 kDa之間，各組的蛋白條帶位置相似，說明蛋白種類無顯著差別。但各組電泳條帶的濃度有一定差異，說明將復合鹽添加到牛肉鹽溶蛋白中，會部分改變蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，影響蛋白質(zhì)的含量，進而影響保水性能。王嵬等[28]研究表明用4%草魚內(nèi)臟水解蛋白液和0.2%復合磷酸鹽溶液，南美白對蝦解凍損失和蒸煮損失都較單獨磷酸鹽組降低，說明蛋白質(zhì)含量的改變能有效促進產(chǎn)品保水性，與本研究結(jié)果相似。

3 結(jié)論

降低磷酸鹽的使用是當前研究熱點，通過本研究發(fā)現(xiàn)，各種磷酸鹽與檸檬酸鹽對牛肉鹽溶蛋白凝膠的保水性均有一定的影響，利用各單鹽之間的協(xié)同增效作用，將SPP、STP、SHP與SC復合，且當四者添加量為2∶2∶2∶3（質(zhì)量比），復合鹽的添加量為0.5%時，凝膠保水率可達94.03%。同時研究發(fā)現(xiàn)pH值對保水率有一定程度的影響，SC的堿性可以促進牛肉肌球蛋白偏離等電點，從而增加保水性。通過對不同鹽溶蛋白進行SDS-PAGE電泳分析可知，復合鹽能改變蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，影響蛋白質(zhì)的含量，從而影響肉的保水性。