吳玥麗 呂 虹 趙 玲 朱重陽(yáng) 趙 暉

河南省婦幼保健院(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院)(450052)

通過(guò)羊水細(xì)胞培養(yǎng)分析染色體核型是目前臨床常用的胎兒染色體異常產(chǎn)前診斷手段,但羊膜腔最佳穿刺時(shí)機(jī)為孕16～22周,孕晚期羊水細(xì)胞死亡率高,繁殖能力大幅下降[1-2]。對(duì)錯(cuò)過(guò)羊水細(xì)胞培養(yǎng)最佳時(shí)機(jī)的孕婦,一般建議行臍靜脈穿刺行遺傳學(xué)診斷,但該技術(shù)檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)較高,對(duì)孕婦及胎兒損傷較大[3]。熒光原位雜交技術(shù)(FISH)能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞內(nèi)特定染色體數(shù)目的檢測(cè)或染色體上特定基因的定位判斷[4]。本研究就羊水細(xì)胞培養(yǎng)聯(lián)合FISH診斷孕中、晚期胎兒染色體異常的臨床價(jià)值進(jìn)行分析,為臨床產(chǎn)前診斷提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年6月－2018年6月本院接受羊水細(xì)胞培養(yǎng)、FISH產(chǎn)前診斷的孕婦2904例,孕婦均符合下列一項(xiàng)或多項(xiàng)產(chǎn)前診斷指征[5]：①血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)；②年齡≥35歲；③既往有染色體異?；純荷?；④超聲可見脈絡(luò)叢囊腫、頸項(xiàng)透明層增厚、心室強(qiáng)回聲、單臍動(dòng)脈等軟指標(biāo)異常；⑤夫婦一方為染色體易位攜帶者或染色體異常。2904名孕婦中位孕周28周(25～37周),中位年齡28歲(25～47歲)。本研究已獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),孕婦及其配偶均簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法

常規(guī)消毒鋪巾,于B超引導(dǎo)下經(jīng)腹抽取羊水30 ml,每例羊水標(biāo)本分為兩份,一份25 ml用于羊水細(xì)胞培養(yǎng),另一份5 ml用于FISH檢測(cè)。

1.2.1羊水細(xì)胞培養(yǎng) 參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[6],分別采用兩套培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)與制片。無(wú)菌環(huán)境下將羊水管離心棄上清,保留每管0.5 ml羊水細(xì)胞層,滴管打勻后分別接種至兩個(gè)50 ml培養(yǎng)瓶底部,再沿培養(yǎng)瓶邊緣分別加入兩種不同的羊水培養(yǎng)液(4.5 ml),確保羊水培養(yǎng)液覆蓋細(xì)胞懸液,37℃5%CO2恒溫箱培養(yǎng)。5～6 d后更換培養(yǎng)液,并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。鏡下可見培養(yǎng)瓶底若干形態(tài)較好的梭形細(xì)胞克隆,繼續(xù)培養(yǎng)并持續(xù)觀察。1～2 d后,待克隆變大且可見成對(duì)圓形透亮細(xì)胞時(shí)收獲細(xì)胞(一般于培養(yǎng)后7～9d收獲細(xì)胞),收獲前4 h加入24μg/ml秋水仙素,使細(xì)胞停止于分裂中期,常規(guī)制片,胰酶消化,G顯帶染色。常規(guī)計(jì)數(shù)20個(gè),分析5個(gè)分散良好的細(xì)胞核型,核型異常者需計(jì)數(shù)50個(gè)分裂相,參照標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行核型分型診斷。

1.2.2 FISH檢測(cè) 5 ml羊水標(biāo)本,使用CSP18/CSPX/CSPY DNA探針和GLP13/GLP21 DNA探針(北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司),參照試劑盒操作說(shuō)明書行標(biāo)本處理、變性、雜交、洗滌等操作。于熒光顯微鏡下選取合適的濾光片觀察熒光信號(hào),計(jì)數(shù)、攝圖保存并分析結(jié)果。結(jié)果判斷[8]：由2人計(jì)數(shù),每組探針計(jì)數(shù)細(xì)胞≥50個(gè),若≥90%細(xì)胞核顯示為正常整倍體信號(hào),則為整倍體；若非整倍體信號(hào)≥60%,則為非整倍體(兩個(gè)信號(hào)點(diǎn)之間的具體≥一個(gè)信號(hào)點(diǎn)的直徑,方可記為兩個(gè)獨(dú)立的熒光信號(hào)；重疊、信號(hào)彌散及微弱均不作記錄)。

1.3 分析方法

分析羊水細(xì)胞培養(yǎng)、FISH檢測(cè)的成功率,以及胎兒染色體異常檢測(cè)結(jié)果,總結(jié)孕中晚期羊水細(xì)胞培養(yǎng)聯(lián)合FISH診斷胎兒染色體異常的臨床價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行分析,染色體異常分類計(jì)數(shù)以(n)表示,構(gòu)成比以(%)表示。

2 結(jié)果

2.1 羊水細(xì)胞染色體核型分析

2904份羊水標(biāo)本中,2815份培養(yǎng)成功(96.9%),標(biāo)本自接種、培養(yǎng)至核型分析均分為兩組,兩組分析2815例羊水染色體結(jié)果均一致。在成功培養(yǎng)的2815份標(biāo)本中,發(fā)現(xiàn)異常核型139例(4.94%),異常染色體核型見表1。

表1 139例染色體異常類型及占比分析

2.2 羊水FISH檢測(cè)結(jié)果分析

2904份羊水標(biāo)本FISH檢測(cè)均成功(100.00%)。FISH檢測(cè)共檢出染色體數(shù)目異常90例,與羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果一致,其余3例染色體核型檢出染色體部分缺失重復(fù),FISH檢測(cè)未見異常；44例染色體結(jié)構(gòu)異常,2例嵌合體(＋mar)異常均未檢出,見表2。

表2 90例羊水FISH檢測(cè)異常結(jié)果分析

3 討論

染色體異常是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的最常見遺傳性疾病[9]。產(chǎn)前篩查能夠在較大范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)唐氏綜合征的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,但受篩查性質(zhì)所限,產(chǎn)前篩查也存在一定假陽(yáng)性、假陰性,需通過(guò)羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析確診[10]。羊膜腔穿刺術(shù)是當(dāng)前臨床常用的有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù),而遺傳學(xué)分析也被認(rèn)為是產(chǎn)前診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法。羊膜腔穿刺一般適用于孕16～22周,孕≥24周后羊水培養(yǎng)失敗率有所上升[11]。若高風(fēng)險(xiǎn)孕婦錯(cuò)過(guò)了羊膜腔穿刺時(shí)機(jī),往往需要接受臍靜脈穿刺,而臍靜脈穿刺風(fēng)險(xiǎn)大、技術(shù)要求高[12]。另外存在穿刺失敗、取血困難[13]。提高孕中晚期羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率,一直是產(chǎn)前診斷領(lǐng)域關(guān)注重點(diǎn)。

本次研究嘗試對(duì)2904名孕中晚期孕婦行羊水細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)成功率達(dá)96.9%,發(fā)現(xiàn)異常核型139例,說(shuō)明對(duì)于孕中晚期孕婦而言,羊水細(xì)胞培養(yǎng)的成功率與診斷效率亦應(yīng)值得肯定,在實(shí)際臨床操作中注重如下環(huán)節(jié),是確保培養(yǎng)成功率的關(guān)鍵：①羊水細(xì)胞有較多上皮細(xì)胞,常在培養(yǎng)早期出現(xiàn),初次更換培養(yǎng)液時(shí)間建議提前1～2 d,如細(xì)胞生長(zhǎng)不良可換液后繼續(xù)培養(yǎng)；也可使用胰蛋白酶消化、收集離心后,將沉淀層吹勻,加適量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),以獲取滿意的貼壁細(xì)胞[14-15]。②在分別使用兩種培養(yǎng)液、兩個(gè)CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),應(yīng)盡量減少開關(guān)溫箱門、鏡下觀察細(xì)胞的次數(shù),避免外在因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)帶來(lái)不良影響。③若細(xì)胞經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)后克隆仍較少且難以繼續(xù)培養(yǎng),收集離心后,在染色體制備過(guò)程中,建議適當(dāng)減少低滲液、固定液含量,或者減少制片數(shù)量,以避免細(xì)胞丟失、保證分裂相的可讀性[16]。

需要注意的是,羊水細(xì)胞培養(yǎng)仍存在一定不足之處,如無(wú)法明確帶型的染色體異常(如標(biāo)記染色體或新發(fā)染色體結(jié)構(gòu)重排)、羊水細(xì)胞染色體嵌合現(xiàn)象等。同時(shí),受光學(xué)顯微鏡分辨率限制,目前僅可辨認(rèn)6×106bp以上的染色體重排,對(duì)微缺失無(wú)法辨認(rèn)[17]。FISH技術(shù)可在48h內(nèi)完成檢測(cè),對(duì)孕周無(wú)嚴(yán)格要求,不要求細(xì)胞必須處于分裂中期,敏感特異性高,具有快速、簡(jiǎn)便、可靠等優(yōu)勢(shì)[17]。本研究結(jié)果示,2904份羊水標(biāo)本FISH檢測(cè)成功率達(dá)100.00%,共檢出染色體數(shù)目異常90例,與羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果一致,有3例染色體部分缺失/重復(fù)、44例染色體結(jié)構(gòu)異常、2例嵌合體FISH均未檢出。由此可見,FISH技術(shù)雖然能夠快速檢出胎兒部分染色體非整倍體異常,但僅可用于特定染色體非整倍體異常(21、18、13、X和Y)的檢出,仍存在一定殘余風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述,孕中、晚期羊水細(xì)胞培養(yǎng)核型分析診斷胎兒染色體異常的臨床價(jià)值值得肯定,在此基礎(chǔ)上聯(lián)合FISH檢測(cè)能夠提高診斷效率,縮短孕婦等待時(shí)間,但FISH技術(shù)無(wú)法替代傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法,僅可作為傳統(tǒng)方法的一項(xiàng)重要補(bǔ)充。