李春艷 鄭 嬌 燕 鳳 程 璐 宋婷婷 陳必良 徐慧 張建芳

空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院(西安,710032)

傳統(tǒng)染色體核型分析是染色體疾病診斷的“金標準”[1],但培養(yǎng)周期長、易培養(yǎng)失敗,對5Mb以下的染色體缺失/重復無法正確檢出。BACs-on-Beads(BoBs)技術(shù)是一種快速產(chǎn)前診斷技術(shù),將DNA探針固定在經(jīng)過熒光編碼的Luminex微球表面,采用微球陣列分析同時檢測5種染色體非整倍體(13、18、21、X和Y)及常見的微缺失綜合征(Wolf-Hirschhorn綜合征、Cri du Chat綜合征、Williams-Beuren綜合征、Langer-Giedion綜合征、Prader-Willi/Angelman綜合征、Miller-Dieker綜合征、Smith-Magenis綜合征及DiGeorge綜合征),大大縮短了檢測時間,提高了產(chǎn)前診斷效率。本文對4639份羊水進行BoBs快速檢測,探討其在檢測微缺失/微重復綜合征中的應用價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2015年1月－2018年3月來本院產(chǎn)前診斷中心接受遺傳咨詢并進行羊水穿刺的孕婦4639例,年齡(28.3±4.0)歲,孕周(20.3±2.5)周。孕婦的產(chǎn)前診斷指征包括：高齡(≥35歲)；血清學篩查高風險；超聲異常；無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(NIPT)高風險；不良孕產(chǎn)史；其他(家族遺傳病史、夫妻一方染色體異常、不良接觸史等)。所有孕婦均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1羊膜腔穿刺 超聲定位及引導下行羊膜腔穿刺,抽取羊水30ml,15ml用于核型分析,10ml用于BoBs檢測,5ml用于熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測。

1.2.2染色體核型分析 15ml羊水無菌操作下進行培養(yǎng),常規(guī)染色體制片、G顯帶,每例樣本分析30個分裂相,采集3～5個核型圖。發(fā)現(xiàn)染色體異?；蚨鄳B(tài)性時,適當增加分析的核型數(shù)。

1.2.3 BoBs檢測 采用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)提取樣本DNA。Prenatal BoBs TM試劑盒(PerkinElmer公司)進行樣本檢測,Luminex 200TM讀取信號強度,BoBsoft 2.0軟件進行結(jié)果分析。

1.2.4熒光原位雜交技術(shù)(FISH) 羊水行細胞處理、玻片處理、雜交、洗片、復染后于熒光顯微鏡下觀察。每例樣本隨機計數(shù)50個細胞,發(fā)現(xiàn)染色體異常時,擴大計數(shù)至100個細胞。

1.2.5染色體芯片分析(CMA) 采用CytoScan 750K Array(Affymetrix公司)檢測基因組DNA拷貝數(shù)變化(CNV)、單親二倍體及雜合性缺失,Ch AS軟件進行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

4639份羊水中BoBs共檢出微缺失/微重復20例(0.43%)。見表1。22q11.2缺失和重復綜合征進行FISH驗證,其余綜合征進行染色體核型分析和CMA驗證,結(jié)果均與BoBs一致。

表1 20例微缺失/微重復綜合征的檢測結(jié)果

染色體核型分析只檢出缺失/重復3例,且其缺失/重復的區(qū)域均大于15Mb,如病例8,核型結(jié)果為46,XX,del(4)(p15.3),BoBs結(jié)果顯示4p16.3缺失,為Wolf-Hirschhorn綜合征,CMA結(jié)果發(fā)現(xiàn)4p 16.3 p15.32(68,345_15,712,119)區(qū)域缺失15.6Mb。病例13,核型結(jié)果為46,XX,del(5)t(4；5)(q28.3；p14.1),BoBs結(jié)果發(fā)現(xiàn)5p15.3-p15.2缺失,為Cri du Chat綜合征,CMA驗證發(fā)現(xiàn)4q28.3q35.2(131,452,554_190,957,473)區(qū)域重復59.5Mb,同時5p15.33p14.1(113,576_26,634,417)區(qū)域缺失26.5Mb,即貓叫綜合征,缺失區(qū)域包含50個OMIM基因。病例20,核型結(jié)果發(fā)現(xiàn)標記染色體存在,不確定其來源,BoBs結(jié)果顯示18p11.32p11.21重復,CMA結(jié)果發(fā)現(xiàn)18p11.32p11.21(136,226_15,143,714)區(qū)域重復15Mb,為18p四體綜合征,電話隨訪得知,孕婦被告知染色體核型分析、BoBs和CMA檢測結(jié)果均異常并進行遺傳咨詢后,均選擇終止妊娠。

病例19,孕婦因血清學篩查21三體高風險行羊水穿刺,BoBs檢測發(fā)現(xiàn)Xp22.31缺失,CMA驗證得 到Xp22.31(6,455,151_8,141,076)x1：1.69Mb,該缺失區(qū)域包括HDHD1、STS、VCX、PNPLA4、VCX2等OMIM基因,STS為遺傳性魚鱗病相關(guān)基因,患者可能有發(fā)育遲緩、魚鱗病、認知能力差等臨床表現(xiàn),但該缺失區(qū)域具有不完全外顯率,臨床表現(xiàn)不完全一致,隨后對孕婦進行CMA檢測,結(jié)果完全一致,其決定繼續(xù)妊娠。病例6,7,17,孕婦得知檢測結(jié)果并進行遺傳咨詢后,均決定繼續(xù)妊娠。

相較于染色體核型分析,BoBs技術(shù)的檢出率增加了0.37%(17/4639),如22q11.2微重復綜合征(病例1,3,12),Smith-Magenis綜合征(病例2),Di-George綜合征(病例4,5),Potocki-Lupski綜合征(病例10),Williams-Beuren綜合征(病例11,15,16)等。

3 討論

目前,染色體核型分析是染色體疾病診斷的“金標準”,但培養(yǎng)周期長、對技術(shù)人員要求高、易培養(yǎng)失敗,導致無法正常時間發(fā)放報告,增加了孕婦的緊張和焦慮情緒。隨著分子細胞遺傳學技術(shù)的發(fā)展,BoBs、FISH、CMA,多重連接依賴探針擴增技術(shù)(MLPA),熒光定量PCR(QF-PCR)等不斷應用于臨床,提高了產(chǎn)前診斷的效率及準確性[2-3]。

本研究利用BoBs技術(shù)聯(lián)合染色體核型分析對4639份羊水進行快速檢測,檢出微缺失綜合征13例,微重復綜合征7例,檢出率為0.43%。產(chǎn)前BoBs結(jié)果與FISH、CMA等檢測結(jié)果一致,體現(xiàn)了該技術(shù)的準確性及在臨床應用的可靠性。染色體核型分析只檢出3例微缺失/微重復(缺失/重復區(qū)域均大于15Mb),聯(lián)合BoBs增加了0.37%的檢出率,避免了單純?nèi)旧w核型分析的假陰性結(jié)果。本研究中微缺失/微重復的檢出率較國內(nèi)外報道降低[4-5],可能與微缺失/微重復綜合征本身的發(fā)病率較低,且樣本量不夠大有關(guān)。

FISH技術(shù)主要用于檢測13、18、21、X和Y染色體非整倍體,對某些特定區(qū)域檢測需定制相應的探針,耗時耗力,BoBs技術(shù)針對9種常見微缺失區(qū)域設(shè)置4～8個探針(9種微缺失綜合征總發(fā)生率約為1/1700[6]),提高了檢測的范圍及效率[7]。近年來,CMA技術(shù)被推薦為胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常檢測的首要手段,同時廣泛應用于先天性心臟病、神經(jīng)發(fā)育異常、智力障礙等臨床評價[8-9],但CMA檢測價格昂貴,會產(chǎn)生很多意義不明確的結(jié)果(VOUS),增加了遺傳咨詢的難度。BoBs技術(shù)快速、經(jīng)濟、靈敏、高通量,不需要進行羊水細胞培養(yǎng),實驗成功率高,結(jié)果明確,易于解讀,是核型分析的有力補充。

Choy等[10]對2153例樣本行染色體核型分析、QF-PCR及BoBs檢測結(jié)果顯示BoBs技術(shù)能準確檢出所有的染色體非整倍體,同時對微缺失綜合征的檢出能力明顯優(yōu)于染色體核型分析及QF-PCR,敏感性為96.7%,特異性為100%。郭克建等[11]通過對921例羊水進行快速診斷發(fā)現(xiàn),BoBs聯(lián)合核型分析的異常檢出率為6.84%,比單一體核型分析提高了16.7%,是一種可選擇的穩(wěn)定準確的新技術(shù)。但是BoBs對點突變、平衡性重排、倍性變化、單親二倍體、甲基化改變及低比例嵌合(＜20%)等無法正確檢出[6],此外母血污染也會影響結(jié)果的判讀,因此遇到陽性結(jié)果時,需結(jié)合染色體核型分析、FISH、CMA等技術(shù)共同判斷[12-13]。臨床醫(yī)生應在檢測前告知孕婦每種技術(shù)的優(yōu)缺點并根據(jù)產(chǎn)前診斷指征進行恰當?shù)牡倪z傳咨詢。

綜上所述,BoBs技術(shù)聯(lián)合核型分析的檢測模式在提高染色體異常檢出率的同時減少了患者的等待時間,適合大量產(chǎn)前診斷樣本的快速處理,值得在臨床中應用。