張思陽 潘 虹 王彬彬*

1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院(100730)；2.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所

子宮內(nèi)膜異位癥被定義為子宮腔以外的部位存在子宮內(nèi)膜組織[1]?；陔p胞胎研究表明,子宮內(nèi)膜異位癥是一種可遺傳的激素依賴性婦科疾病,且基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜異位癥表型表現(xiàn)影響巨大[2-3]。這種慢性炎癥性疾病影響6%～10%育齡婦女[4],30%～50%伴有盆腔疼痛并與不孕有關(guān)[5-6]。Brosens I等研究表明,局部雌激素的生成維持子宮內(nèi)膜異位種植,子宮內(nèi)膜異位癥作為一種慢性炎癥性疾病,可破壞整個(gè)生殖道孕酮協(xié)同反應(yīng),導(dǎo)致出現(xiàn)“孕酮抵抗”[7]。諸多研究致力尋找子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)記物,但其在月經(jīng)周期不同階段具有不同的基因表達(dá)特征[8]。因此,尋找月經(jīng)周期不同階段均適用的生物學(xué)標(biāo)記物充滿了方法學(xué)困難。GEO數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)是 由美國國立生物技術(shù)信息中心創(chuàng)建并維護(hù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫,GEO序列將樣本組成有意義的數(shù)據(jù)集,每個(gè)數(shù)據(jù)集依靠一個(gè)公共屬性構(gòu)成一個(gè)實(shí)驗(yàn)。序列號(hào)具有“GSE”前綴[9]。KEGG(http：//www.kegg.jp/或http：//www.genome.jp/kegg/)是了解高級功能和生物系統(tǒng)(如細(xì)胞、生物和生態(tài)系統(tǒng)),從分子水平信息,尤其是大型分子數(shù)據(jù)集生成的基因組測序和其他高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)的實(shí)用程序數(shù)據(jù)庫資源[10]。GO,KEGG,PPI網(wǎng)絡(luò)目前已被廣泛應(yīng)用于各類癌癥的潛在致病基因及候選生物標(biāo)志物的篩選及預(yù)后分析,包括胃癌[11],口腔鱗癌[12]等。2016年Kori M等首次從醫(yī)學(xué)網(wǎng)絡(luò)角度進(jìn)行研究,為包括子宮內(nèi)膜異位癥在內(nèi)的累及卵巢的疾病提供了可能的潛在治療靶點(diǎn)和(或)后續(xù)實(shí)驗(yàn)和臨床研究中作為醫(yī)學(xué)預(yù)后生物標(biāo)記物的特征譜[13]。然而至今為止,鮮有文章聚焦于月經(jīng)周期不同階段,探究月經(jīng)周期不同階段子宮內(nèi)膜異位癥患者共享的潛在致病基因,從而從遺傳背景探究具有月經(jīng)周期不同階段普適性的子宮內(nèi)膜異位癥的標(biāo)志物,本文對此進(jìn)行研究。

1 資料和方法

1.1 差異表達(dá)基因(DEGs)

以組合關(guān)鍵詞“endometriosis,Homo”在NCBI基因芯片公共數(shù)據(jù)庫GEO檢索芯片庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),下 載 微 陣 列 芯 片 系 列GSE7305,GSE25628,分析時(shí)剔除GSE25628系列中健康對照組在位子宮內(nèi)膜組織組別數(shù)據(jù),僅保留患者的在位子宮內(nèi)膜及異位子宮內(nèi)膜組別的數(shù)據(jù)。使用GSE25628及GSE7305中“Ectopic endometrium”及“Euctopic endometrium”的組織。GSE7305：所有子宮內(nèi)膜異位癥樣本都是卵巢樣本,卵巢子宮內(nèi)膜異位癥病灶與同一患者子宮內(nèi)膜在位組織于手術(shù)時(shí)同時(shí)獲得；GSE25628：在位或異位子宮內(nèi)膜組織的臨床樣本均取自因不孕、盆腔疼痛癥狀或附件腫塊接受手術(shù)的子宮內(nèi)膜異位癥患者。深度浸潤性子宮內(nèi)膜異位癥的診斷依據(jù)腹腔鏡手術(shù)。8名患者的異位子宮內(nèi)膜和對應(yīng)匹配的患者在位子宮內(nèi)膜手術(shù)時(shí)獲得。GSE25628中包含處于增殖期的子宮內(nèi)膜異位癥患者的8例在位子宮內(nèi)膜及8例異位子宮內(nèi)膜組織,GSE7305共有10例在位子宮內(nèi)膜及10例異位子宮內(nèi)膜(卵泡期/增殖期2例、黃體期/分泌期8例)。使用GEO數(shù)據(jù)庫基于R語言GEOquery和limma程序包的在線分析工具GEO2R(http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)以P＜0.05,|log FC|＞1.5為條件進(jìn)行篩選,分別對兩個(gè)數(shù)據(jù)集的子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位組織與異位組織進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。對上述2個(gè)系列的數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因取交集進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 差異表達(dá)基因的功能富集分析

使用R語言的Clusterprofiler包對兩個(gè)數(shù)據(jù)集共有的DEGs進(jìn)行基因本體論分析及KEGG通路的富集分析。

1.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析及熱點(diǎn)模塊篩選

利用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)分析兩數(shù)據(jù)集共有的DEGs蛋白相互作用。設(shè)置有效結(jié)合分?jǐn)?shù)＞0.4。通過Cytoscape_3.7.1對結(jié)果建立模型,并使用MCODE插件進(jìn)行熱點(diǎn)模塊篩選。Degree Cutoff設(shè)置為2,Node Score Cutoff設(shè)置為0.2,K-core設(shè)置為0.2,Max deepth設(shè)置為100。使用使用BiNGO插件對熱點(diǎn)模塊中的基因簇進(jìn)行GO富集分析。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選

經(jīng)GEO2R分析,GSE25628共有160個(gè)上調(diào)的DEGs,18個(gè)下調(diào)的DEGs；GSE7305共有452個(gè)上調(diào)的DEGs,393個(gè)下調(diào)的DEGs。兩個(gè)數(shù)據(jù)集共享的在位組織與異位組織的差異表達(dá)基因共96個(gè),在兩個(gè)不同的數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)共有14個(gè)DEGs同時(shí)下調(diào),82個(gè)DEGs同時(shí)上調(diào)(圖1見插頁)。

2.2 差異表達(dá)基因GO富集分析

對共有的差異基因進(jìn)行GO分析,包含3個(gè)模塊,生物學(xué)功能(BP),細(xì)胞組成(CC)及分子功能(MF)。BP,CC,MFP 3個(gè)模塊P值最小的前10項(xiàng)富集通路的結(jié)果見圖2(見插頁)。

2.3 差異表達(dá)基因KEGG信號(hào)通路分析

KEGG結(jié)果顯示,8項(xiàng)信號(hào)通路具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3見插頁)。

2.4 差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING 11.0進(jìn)行差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)分析。在去除分離和部分連接的節(jié)點(diǎn)后,通過Cytoscape構(gòu)建了一個(gè)復(fù)雜的DEGs網(wǎng)絡(luò),顯示出顯著相互作用的重要基因(圖4見插頁)。

2.5 Cytoscape MCODE分析熱點(diǎn)模塊

使用MCODE插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,共得到了3個(gè)符合條件的熱點(diǎn)模塊,共涉及22個(gè)基因(表1)。

2.6 使用BiNGO對熱點(diǎn)模塊的基因進(jìn)行GO分析

將MCODE分析后的熱點(diǎn)模塊基因進(jìn)行GO分析,結(jié)果顯示P值由小到大,排名前5的模塊依次為肌肉收縮、肌肉系統(tǒng)過程、細(xì)胞外基質(zhì)組織、補(bǔ)體激活、急性炎癥反應(yīng)中血漿蛋白的激活(表2)。

表1 Cytoscape MCODE分析熱點(diǎn)模塊

表2 MCODE熱點(diǎn)模塊基因GO分析最具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異前五項(xiàng)

3 討論

CLU(Clusterin)自首次發(fā)現(xiàn)和鑒定以來,研究人員一直致力于揭示其在哺乳動(dòng)物中的生物學(xué)作用。盡管人們普遍認(rèn)為CLU在幾乎所有的基本生物學(xué)現(xiàn)象和包括癌癥在內(nèi)的許多人類疾病中都扮演著重要的角色,但至今CLU被定義為一種“神秘的”蛋白質(zhì)。CLU基因是一個(gè)在進(jìn)化過程中非常保守的基因,位于人類8號(hào)染色體(8p21-p12)上,在許多器官組織受損中表達(dá)[14]。其過度表達(dá)應(yīng)被認(rèn)為是對多種組織損傷的非特異性細(xì)胞反應(yīng)[15]。

CLU基因至少產(chǎn)生3種蛋白質(zhì)形式,具有不同的亞細(xì)胞定位和不同的生物學(xué)功能。這些蛋白質(zhì)形式產(chǎn)生的分子機(jī)制尚不清楚。最著名的是糖基化成熟型CLU(sCLU),不同部位分泌量存在很大差異。激素和生長因子是CLU基因表達(dá)最重要的調(diào)控因子[16]。諸多研究表明CLU與卵巢癌、結(jié)腸癌等發(fā)生有聯(lián)系,且癌灶組織中CLU水平升高與疾病的不良結(jié)局有關(guān)[17]。在多種癌癥治療中具有較高的調(diào)節(jié)作用[18],研究表明靶向s-CLU可能提高卵巢癌患者的生存率[19],CLU通過與m RNA sCLU的外顯子1結(jié)合阻斷其翻譯,而過度表達(dá)sCLU的腎癌細(xì)胞對凋亡的抵抗力增強(qiáng)[20]。靶向sCLU的寡核苷酸增加了前列腺癌細(xì)胞對輻射的敏感性[21]。靶向sCLU的寡核苷酸增加了對化療藥物的敏感性[22]。然而CLU基因是否與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)的研究卻十分有限。

最新研究表明在人類子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的頂端區(qū)域檢測到CLU和巨蛋白,大部分是分泌細(xì)胞[23-24]。免疫組織化學(xué)分析顯示,在人類子宮內(nèi)膜中CLU優(yōu)先定位于腺體中[25]。研究者通過免疫組織化學(xué)和ELISA鑒定出CLU不僅在分泌后期存在蛋白表達(dá),在增殖期宮頸粘液中CLU也同樣表達(dá)[26]。

Fuzio等研究發(fā)現(xiàn)CLU的表達(dá)在月經(jīng)周期間沒有差異[27]。然而,最新的研究表明CLU的表達(dá)受孕激素水平影響且與子宮內(nèi)膜異位癥患者的生育能力相關(guān)。晚期分泌期組織重組的孕激素水平下降可能在子宮上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)CLU表達(dá)[28]。Simone Ferrero等一項(xiàng)涉及52例子宮內(nèi)膜異位癥患者的腹膜液分析,包括26例生育能力正常及26例不孕患者,發(fā)現(xiàn)不孕婦女腹膜液中CLU蛋白水平明顯高于生育能力正常者[29]。

CLU是補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子[30],研究表明CLU參與補(bǔ)體激活,而補(bǔ)體途徑在子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)卵巢癌中常發(fā)生改變[31]；2018年P(guān)alomino WA等發(fā)現(xiàn)異位子宮內(nèi)膜在分泌中期表現(xiàn)出補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)異常[32]。除此之外,研究者指出補(bǔ)體系統(tǒng)激活調(diào)節(jié)機(jī)制的損害可能是子宮內(nèi)膜異位癥及相關(guān)不孕癥發(fā)病的重要因素[33]。

本研究結(jié)果表明,CLU是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生進(jìn)展過程中增殖期及分泌期共享的樞紐基因之一,可能介導(dǎo)調(diào)控補(bǔ)體級聯(lián)通路參與作用于子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。CLU可能作為潛在的子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物,為增殖期及分泌期共享。不過這一初步結(jié)論仍需后續(xù)擴(kuò)大樣本量,分析月經(jīng)周期不同階段子宮內(nèi)膜異位在位組織,及健康對照子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行驗(yàn)證。更多聚焦于CLU與補(bǔ)體激活及子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生進(jìn)展的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn),從而探究孕激素與CLU表達(dá)關(guān)系,及CLU參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生進(jìn)展的潛在分子機(jī)制。