鄭佳豪 李少南 程 攻

(浙江大學農藥與環(huán)境毒理研究所，浙江 杭州 310029)

浮游動物在水生生態(tài)系統(tǒng)的物質循環(huán)和能量流動中起著重要作用，其群落結構可以動態(tài)反映生態(tài)系統(tǒng)對環(huán)境脅迫的響應。當受到農藥等環(huán)境污染脅迫時，不同生態(tài)位的浮游動物會有不同的反應，通過觀測浮游動物的種群及群落變化，可以對水生生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況進行預測。毒死蜱作為中國乃至全球范圍內應用最廣泛的有機磷殺蟲劑之一，其對水生生物的影響已在室內和室外環(huán)境中均有廣泛的研究，并得到了相應的效應臨界值，如最高無作用濃度(NOEC)和最低有效濃度(LOEC)[1-2],[3]20,[4],[5]25,[6]。在農藥的風險評估工作中，效應的臨界值是非常重要的信息，過去的研究中通常只獲得了NOEC或LOEC的理論濃度，本研究將嘗試使用時間加權平均濃度。

隆線溞(Daphniacarinata)是水體中常見的甲殼綱動物[7-9]，有著易飼養(yǎng)、繁殖快的優(yōu)點，是生態(tài)毒理學研究的理想受試生物[10]，但隆線溞很難單獨生長。中華薄殼介(Dolerocyprissinensis)作為一類新興的實驗動物，正逐漸受到人們的關注[11]，本研究將其與隆線溞組成混合種群，來研究毒死蜱對于隆線溞和中華薄殼介混合種群的影響。

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)是幾丁質水解酶的一種，其在水中的主要來源是甲殼綱動物在蛻皮時分泌的蛻皮液[12]。NAGase比活力在個體層面與動物的體長、體重等相關，在群體層面與種群生物量相關，故可通過測定NAGase比活力來判斷農藥對甲殼綱浮游動物的影響[13]。

由于幾丁質水解酶來源的多重性[14-17]，而且水中的其他化學物質可能會促進或抑制NAGase的酶促反應，因此NAGase比活力的測定結果往往不能夠準確反映被暴露種群的生物量。本研究選擇了用特異性抗體測定抗原含量的方法來彌補這一缺陷?？紤]到幾丁質酶(chitinase)也存在于蛻皮液并與NAGase一起隨著蛻皮過程的結束而釋放到水中[18]，本研究以隆線溞該酶基因原核表達蛋白制備抗體，用間接非競爭酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測其游離態(tài)幾丁質酶免疫可反應蛋白(chitinase-IR)來表征它的chitinase。因此，本研究擬通過種群密度、NAGase比活力和隆線溞chitinase-IR的測量來反映隆線溞和中華薄殼介混合種群在毒死蜱脅迫下的變化。

1 材料與方法

1.1 受試生物

隆線溞和中華薄殼介均采集自浙江大學華家池，在曝氣后自來水(pH=7.4±0.1、電導率(178±2) μS、總溶解性鹽(126±2) mg/L、溶解氧(8.0±0.3) mg/L)中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制為(25±1) ℃，預培養(yǎng)30 d后作為含隆線溞和中華薄殼介的培養(yǎng)液。

1.2 試驗設計

取18個圓柱形玻璃水缸，給藥前15天，每缸接種含隆線溞和中華薄殼介的培養(yǎng)液各1 L，再加入曝氣后自來水至10 L，最終接種密度為：隆線溞506只/L，中華薄殼介378只/L，每3天添加30 mL螺旋藻粉溶液(2.78 g/L)，使兩種動物自然生長。給藥后每天進行16 h光照(光照強度2 000～3 000 lx)，8 h黑暗處理，只要動物生物量還處于動態(tài)平衡狀態(tài)，就不再添加螺旋藻粉溶液。

給藥方法：先將毒死蜱原藥用丙酮配制成1 000、100、10 mg/L 3種母液。加入1 000 mg/L的母液52.5 μL得到毒死蜱質量濃度為5.25 μg/L的試驗組；分別加入100 mg/L的母液164.0、51.0 μL得到毒死蜱質量濃度為1.64、0.51 μg/L的試驗組；分別加入10 mg/L的母液160.0、50.0 μL得到毒死蜱質量濃度為0.16、0.05 μg/L的試驗組；僅添加丙酮得到毒死蜱質量濃度為0 μg/L的試驗組作為對照。所有試驗組都添加丙酮量至164 μL。每組設立3個重復。

1.3 取 樣

參考郎倩萍[19]的取樣設計進行取樣(見表1)，取樣后用等量曝氣后自來水補充，浮游動物計數(shù)完畢后重新送回。

1.4 樣品測定

1.4.1 殘留毒死蜱

水樣過0.22 μm濾膜后參考周艷明等[20]的方法進行固相萃取，固相萃取方法回收率為93.6%～107.8%，相對標準偏差為2.79%～4.89%。

固相萃取后用Agilent 7890b氣相色譜儀進行檢測，檢測器為電子捕獲檢測器，色譜柱為HP-5毛細管柱(0.32 mm×30 m×0.25 μm)。升溫程序為150 ℃保持2 min，以15 ℃/min升溫至190 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫至240 ℃；不分流進樣，進樣體積為1 μL，進樣口溫度為240 ℃；檢測器溫度為250 ℃，載氣用高純氮氣(純度99.999%)，恒壓為103.425 kPa。毒死蜱的保留時間為8.700 min，檢出限為0.005 μg/L。

1.4.2 浮游動物種群密度

由于中華薄殼介大多貼缸壁生活，所以計數(shù)前先要進行攪動，然后取100 mL水樣對隆線溞與中華薄殼介進行肉眼計數(shù)，重復10次后取平均數(shù)，計算種群密度。

1.4.3 幾丁質水解酶

將待測水樣通過0.22 μm的微孔濾膜抽濾處理后，測定幾丁質水解酶，其中NAGase比活力參考HANSON等[21]的方法測定，檢出限為0.003 3 U/L。

利用郎倩萍等[22]研究得到的隆線溞chitinase原核表達蛋白制備多克隆抗體。參考KITTELBERGER等[23]的方法進行間接非競爭ELISA，篩選出抗體的最適反應濃度[24]。在抗體最適反應濃度下，再用間接非競爭ELISA測量隆線溞chitinase-IR，檢出限為0.024 1 μg/mL。

參考文獻[25]，選取5種甲殼綱動物(鋸緣真劍水蚤(Eucylopsserrulatus)、中華薄殼介、掌肢新米蝦(Neocaridinapalmata)、隆線溞和老年低額溞(Simocephalusvetulus))進行抗體交叉反應性測定，結果表明，隆線溞與隆線溞、老年低額溞的交叉反應率分別為100.00%、10.46%，而與鋸緣真劍水蚤、中華薄殼介、掌肢新米蝦的交叉反應率均小于0.28%。由此可見，測定的chitinase-IR確實為隆線溞產生的。

表1 取樣設計

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用DPS?軟件進行方差分析和多重比較分析[26]。使用CANOCO 5軟件進行冗余分析(RDA)[27]。

2 結果與分析

由表2可見，殘留毒死蜱隨時間的延長逐漸降低，這是因為毒死蜱會發(fā)生光解[28-30]，也存在揮發(fā)和缸壁的物理吸附等情況。殘留毒死蜱隨時間的變化按式(1)進行擬合[31],[32]4，得到表3。各試驗組的降解速率均隨時間延長逐漸降低，這是由于毒死蜱的降解產物三氯苯酚對酶促反應和微生物有抑制作用[32]5,[33]?？傮w而言，毒死蜱質量濃度越高的試驗組，其平均降解速率越快。

y=ae-bx

(1)

式中：y為殘留毒死蜱質量濃度，μg/L；x為時間，d；a、b分別為擬合系數(shù)。

表2 殘留毒死蜱質量濃度1)

表3 毒死蜱的衰減方程

從圖1可以看出，在低質量濃度(0.05 μg/L)毒死蜱作用下，毒死蜱可能對隆線溞及中華薄殼介有一定的刺激作用；但在質量濃度高于0.05 μg/L的毒死蜱作用下，兩種生物的種群密度基本均隨毒死蜱暴露濃度的升高而降低。不過，在試驗后期，隨著水中殘留的毒死蜱濃度降低，兩種生物的種群密度基本不再減少，隆線溞的種群密度甚至還出現(xiàn)了回升。

圖1 毒死蜱脅迫下的浮游動物種群密度變化Fig.1 Zooplankton population density variation under chlorpyrifos exposure

從圖2(a)可以看出，在施藥之后，隨著時間的延長，毒死蜱逐漸對NAGase比活力產生了抑制作用，特別是0.51、1.64、5.25 μg/L的試驗組，但隨著水中殘留的毒死蜱濃度降低，與浮游植物種群密度變化類似，試驗后期NAGase比活力又有所回升。從圖2(b)可以看出，隆線溞chitinase-IR變化與NAGase比活力變化基本一致，但由于抗體的特異性，隆線溞chitinase-IR變化與隆線溞種群密度的變化更加一致。

3 討 論

基于表4的多重比較結果，得到毒死蜱針對各測定參數(shù)的NOEC和LOEC理論值(分別記為NOECnominal和LOECnominal)，再根據(jù)參考文獻[34]中推薦的算法算出與NOECnominal或LOECnominal相對應的時間加權平均濃度，分別記為NOECTWA和LOECTWA，結果如表5所示。

由表5可見，毒死蜱對隆線溞種群密度的LOECTWA為0.172 μg/L，明顯高于對中華薄殼介種群密度的LOECTWA(0.051 μg/L)，說明中華薄殼介對毒死蜱的敏感性要高于隆線溞，這也解釋了隆線溞的種群恢復速率比中華薄殼介快。NOECTWA的結果也同樣說明這一問題。

RDA表明，隆線溞和中華薄殼介的因變量分值分別為-0.908 1、-1.084 1，表明毒死蜱對中華薄殼介的總體影響比對隆線溞強烈，這與表5中NOECTWA或LOECTWA的表征結論一致。

本研究中涉及兩種幾丁質水解酶，分別是chitinase和NAGase。在NAGase比活力測定中，膠體幾丁質、對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷、4-甲基傘形酮-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUF-NAG)均可以作為底物。以膠體幾丁質作為底物[35]時，由于膠體幾丁質的水解一般會受到chitinase的制約，導致測定結果不能完全作為NAGase活性的判斷依據(jù)[36]，因此本研究以4-MUF-NAG作為底物，使NAGase比活力測定結果更加可靠。

圖2 毒死蜱脅迫下NAGase比活力和隆線溞chitinase-IR變化Fig.2 NAGase specific activity and chitinase-IR of Daphnia carinata under chlorpyrifos exposure

表4 各測定參數(shù)多重比較結果1)

表5 各測定參數(shù)的時間加權平均濃度計算結果

對NAGase比活力和隆線溞chitinase-IR進行RDA發(fā)現(xiàn)，酶指標對毒死蜱的反應不如種群密度敏感，但隆線溞chitinase-IR的敏感性高于NAGase比活力。

4 結 論

在毒死蜱質量濃度高于0.05 μg/L的條件下，毒死蜱對兩種生物會有抑制作用，并且基本隨暴露濃度的升高而增強。不過，隨著水中殘留的毒死蜱濃度降低，抑制作用會減弱。計算毒死蜱對隆線溞和中華薄殼介的NOEC和LOEC發(fā)現(xiàn)，中華薄殼介對毒死蜱的敏感性高于隆線溞。在生態(tài)風險評估工作中， NOEC或LOEC使用時間加權平均濃度會使評價結果更加準確。

(致謝：隆線溞經過南開大學生命科學學院王新華教授鑒定，中華薄殼介經過華東師范大學生命科學學院禹娜教授鑒定，在此一并表示感謝！)