徐儉樸 何 飛 陳園園 韓佳穎

結(jié)核病目前仍是威脅人類健康的主要傳染性疾病之一，每年全球大約新發(fā)病例1000 萬例以上[1]。涂陰肺結(jié)核在臨床上較為常見，國內(nèi)統(tǒng)計表明涂陰肺結(jié)核大約占總肺結(jié)核患者的66.43%，由于此類患者常規(guī)痰檢無法檢測出抗酸桿菌，在診斷上存在許多難點[2]。同時，傳統(tǒng)結(jié)核病病原學(xué)檢測敏感度低、時效長，已無法滿足臨床需要，因此急需尋找一種涂陰肺結(jié)核早期快速診斷方法[3]。近年來，電子氣管鏡局部肺泡灌洗技術(shù)在肺部疾病診治中應(yīng)用越來越普及，為取到合格病原學(xué)標(biāo)本提供了方法。本研究通過觀察肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）結(jié)核分枝桿菌檢測/利福平耐藥檢測系統(tǒng)（Xpert MTB/RIF）、結(jié)核分枝桿菌RNA（TB-RNA）和結(jié)核分枝桿菌DNA（TB-DNA）聯(lián)合檢測技術(shù)對涂陰肺結(jié)核的診斷，從而尋找一種早期快速診斷涂陰肺結(jié)核的方法。

1 臨床資料

1.1 一般資料 2018 年1 月—2018 年12 月浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院收治的疑似肺結(jié)核患者115 例，三次痰抗酸桿菌涂片均為陰性，進行肺部CT 和電子支氣管鏡檢查，最終診斷為涂陰肺結(jié)核患者78 例作為觀察組，均符合《中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南2008 年版》[4]中涂陰肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)進一步檢查如經(jīng)皮肺穿刺活檢，血結(jié)核感染T 細(xì)胞檢測（TSPOT）及診斷性抗感染治療等排除肺結(jié)核患者37 例作為對照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）肺部CT 和臨床癥狀考慮為疑似肺結(jié)核患者，不同時間點三次抗酸桿菌涂片陰性；（2）年齡18～70 周歲；（3）既往無結(jié)核病史及相關(guān)治療史；（4）無電子支氣管鏡檢查相關(guān)禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）研究實施前或過程中被確診非結(jié)核分枝桿菌病患者；（2）合并重大心肺疾??；（3）存在電子支氣管鏡檢查禁忌證；（4）重癥肺結(jié)核患者。

2 研究方法

2.1 觀察指標(biāo)及方法 根據(jù)兩組研究對象BALF 中Xpert MTB/RIF、TB-RNA 和TB-DNA 檢測結(jié)果，計算觀察組中各指標(biāo)診斷涂陰肺結(jié)核的敏感性和特異性。敏感性=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；特異性=真陰性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%。

2.1.1 電子支氣管鏡肺泡灌洗 所有研究對象均采用奧林巴斯電子支氣管鏡檢查（型號BF-1T260 或BF-1T240），根據(jù)肺部CT 提示病灶所在部位進行定位灌洗，首先在灌洗的肺段經(jīng)活檢孔注入2%利多卡因1～2mL 局部麻醉，然后支氣管鏡頂端嵌入目標(biāo)支氣管段開口，經(jīng)操作孔道快速注入室溫滅菌生理鹽水，總量約100mL，分次注入，每次20mL，最后立即負(fù)壓吸引回收灌洗液送檢TB-DNA、TB-RNA、Xpert MTB/RIF 和960 分枝桿菌快速培養(yǎng)。

2.1.2 BALF 標(biāo)本Xpert MTB/RIF 檢測 取BALF標(biāo)本5mL 與SR 痰標(biāo)本處理液（含氫氧化鈉和異丙醇）按2：1 均勻混合后，室溫靜置15min，將混合液移入MTB/RIF 檢測試劑盒（美國Cepheid 公司，批號1000079291）反應(yīng)盒中，置于Gene Xpert 儀（GX-XVI，美國Cepheid 公司）中進行檢測。

2.1.3 BALF 標(biāo)本TB-RNA 及TB-DNA 檢測 結(jié)核菌RNA 試劑盒是由上海仁度公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒（批號20180301），根據(jù)試劑盒說明在羅氏熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)核酸擴增（PCR）儀（Roche Cobas 480，美國羅氏公司）進行檢測并記錄結(jié)果；結(jié)核菌DNA 試劑盒是由北京博奧公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌核酸試劑盒（批號20180303），根據(jù)試劑盒說明在實時熒光定量檢測儀（SLAN-96S Real-Time PCR System 廈門致善生物科技有限公司）進行檢測并記錄結(jié)果。

2.1.4 觀察組BALF 標(biāo)本分枝桿菌液體培養(yǎng) BALF標(biāo)本分枝桿菌液體培養(yǎng)采用Bactec MGIT960 液體培養(yǎng)基（批號7233900、7272656，美國BD 公司）按照《結(jié)核病實驗室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[5]中的操作程序進行。

2.2 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 和Medcalc 15統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗，如理論頻數(shù)T＜5 但≥1，采用連續(xù)校正χ2檢驗，如理論頻數(shù)＜1，采用Fisher'精確檢驗。計算各檢測方法診斷效能采用ROC 曲線分析（Medcalc 15）。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 兩組研究對象一般資料比較 觀察組78 例，男44 例，女34 例，年齡（41.63±12.23）歲，病程（33.40±8.64）天。對照組37 例，男25 例，女12 例，年齡（42.21±11.41）歲，病程（31.11±9.73）天。兩組研究對象年齡、病程比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 兩組研究對象BALF Xpert MTB/RIF、TB-RNA和TB-DNA 檢測陽性率比較 觀察組BALF Xpert MTB/RIF、TB-RNA 和TB-DNA 陽性率均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組研究對象BALF Xpert MTB/RIF、TB-RNA和TB-DNA 檢測陽性率比較[例（%）]

3.3 觀察組BALF 分枝桿菌培養(yǎng)與Xpert MTB/RIF、TB-RNA 和TB-DNA 檢測陽性率比較 BALF分枝桿菌培養(yǎng)陽性率為32.05%（25/78），陽性率為67.95（53/78）。25 例陽性患者中，20 例Xpert MTB/RIF 陽性，22 例TB-RNA 陽性，23 例TB-DNA 陽性。53 例陰性患者中，23 例Xpert MTB/RIF 陽性，26 例TB-RNA 陽性，25 例TB-DNA 陽性。培養(yǎng)陽性組Xpert MTB/RIF、TB-RNA 和TB-DNA 陽性率均顯著高于培養(yǎng)陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 觀察組BALF 分枝桿菌培養(yǎng)與Xpert MTB/RIF、TBRNA 和TB-DNA 檢測陽性率比較[例（%）]

3.4 三種檢測方法診斷涂陰肺結(jié)核的價值分析Xpert MTB/RIF 法、TB-RNA、TB-DNA 三種檢測方法ROC 曲線比較，曲線下面積（AUC）聯(lián)合檢測組與Xpert MTB/RIF 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與TBRNA 及TB-DNA 相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。聯(lián)合檢測組Youden 指數(shù)最高。三種檢測方法的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確性見表3。

表3 三種檢測方法診斷涂陰肺結(jié)核的敏感性和特異性分析

4 討論

涂陰性肺結(jié)核患者臨床表現(xiàn)不一，輕重各異，其中部分患者無癥狀，肺部影像學(xué)缺乏特異性，均給診斷造成一定難度[6]。傳統(tǒng)的診斷方法如痰結(jié)核菌培養(yǎng)，其靈敏度較低，且耗時較長，往往需要數(shù)周時間，與臨床結(jié)核病快速診斷的要求不符[7]。TB-RNA 檢測是一項恒溫擴增實時熒光檢測技術(shù)，檢測速度快，同時由于TB-RNA 只存在活菌中，結(jié)核菌死亡后RNA會很快發(fā)生降解，因此這種方法能夠有效輔助診斷肺結(jié)核病,以及評估抗結(jié)核治療療效[8]。TB-DNA 檢測是一種實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR）檢測技術(shù)，其靈敏度和特異度均較高，但它不能作為抗結(jié)核療效評估，因為死菌DNA 在體內(nèi)可以維持很長一段時間[9]。Xpert MTB/RIF 檢測技術(shù)是一個快速結(jié)核菌檢測平臺，它是一種熒光定量PCR 體外診斷技術(shù)，最快2h 就能診斷出結(jié)果。近年研究證實該技術(shù)在涂陰肺結(jié)核診治中具有較高的靈敏度，臨床應(yīng)用越來越成熟，但這種方法亦不能作為抗結(jié)核療效評估[10]。

觀察組中培養(yǎng)陰性組三種檢測方法的陽性率均顯著低于培養(yǎng)陽性組（P＜0.01），與臨床認(rèn)知是一致的。與對照組比較，觀察組三種檢測方法陽性率均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。聯(lián)合檢測組診斷的靈敏度88.00%，特異度為58.49%，較Xpert MTB/RIF 有顯著提高（P＜0.05），而與TB-RNA檢測組及TB-DNA 檢測組無顯著差異，考慮是否與樣本數(shù)量不足有關(guān)。

研究顯示，Xpert MTB/RIF、TB-RNA 和TB-DNA聯(lián)合檢測可準(zhǔn)確、有效、快速地明確涂陰肺結(jié)核的診斷，縮短診斷時間，使患者能夠得到及時治療，同時TB-RNA 還可作為抗結(jié)核治療療效的評估，指導(dǎo)治療，故三種方法聯(lián)合檢測值得臨床推廣。