謝益文 徐素美 陳芝蕓 楊晴柔 何蓓暉

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率與日俱增，已成為最常見(jiàn)的慢性肝病之一。其疾病譜范圍從單純性脂肪肝到脂肪性肝炎，并逐漸向肝硬化、肝癌等終末期肝病進(jìn)展[1]。研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD 中聚集著肝細(xì)胞衰老現(xiàn)象[2-3]。課題組前期采用高脂誘導(dǎo)小鼠NAFLD 模型發(fā)現(xiàn)，隨高脂喂養(yǎng)時(shí)間的增加，模型動(dòng)物血脂紊亂加重，血清肝酶逐步增高；肝組織病理顯示，在8 周時(shí)肝臟以肝細(xì)胞脂肪變?yōu)橹?，有輕度炎癥的表現(xiàn)；16 周時(shí)肝組織脂肪變加重，炎癥明顯，并有肝細(xì)胞氣球樣變的表現(xiàn)；至24 周時(shí)肝組織在脂肪變和炎癥基礎(chǔ)上出現(xiàn)纖維化的表現(xiàn)[4]。為進(jìn)一步研究肝細(xì)胞衰老在NAFLD 進(jìn)程中的作用，本研究動(dòng)態(tài)觀察高脂誘導(dǎo)的NAFLD 模型小鼠8、16、24 周3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)肝組織肝細(xì)胞衰老相關(guān)基因細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A（P21）、沉默信息細(xì)節(jié)因子6（SIRT6）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）表達(dá)的變化，探討SIRT6/NF-κB 通路在阻遏NAFLD 模型小鼠肝細(xì)胞衰老的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 48 只健康雄性8 周齡C57BL/6 小鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（190±10）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)[SCXK（滬）2017-0005]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障系統(tǒng)中，溫度（20±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)倫理審核通過(guò)（批準(zhǔn)編號(hào)：10717）。

1.2 試 劑 高脂飼料（批號(hào)20170227）為南通特洛菲飼料科技有限公司提供；總RNA 提取試劑盒（批號(hào)AK1703）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)AK5301）、熒光定量PCR 試劑盒（批號(hào)AH80345A）為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.3 引 物 P21、SIRT6、NF-κB mRNA 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)在限公司設(shè)計(jì)并合成。用β-actin 作為內(nèi)參。引物序列如下：SIRT6 上游引物：5'-CTCCAGCGTGGTTTTCCACA-3'，下游引物5'-GCCCATGCGTTCTAGCTGA-3'，擴(kuò)增片段：184bp；P21上游引物：5'-CCTGGTGATGTCCGACCTG-3'，下游引物5'-CCATGAGCGCATCGCAATC-3'，擴(kuò)增片段：103bp；NF-κB 上游引物：5'-ATGGCAGACGAT-GATCCCTAC-3'，下游引物：5'-CGGAATCGAAATCCCCTCTGTT-3'，擴(kuò)增片段：117bp；β-actin 上游引物5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，下游引物5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3'，擴(kuò)增片段：138bp。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及造模 48 只小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組，每組24 只，每日稱重，正常組小鼠每天予普通飼料喂養(yǎng)，模型組小鼠每天予高脂飼料（10%熟豬油、5%蛋黃粉、2%膽固醇、0.5%3 號(hào)膽鹽、普通飼料82.5%）喂養(yǎng)。正常組和模型組分別于喂養(yǎng)第8、16、24 周末各處理8 只小鼠。具體處理方法：小鼠處理前晚禁食不禁水，次日上午空腹麻醉下取肝組織，-80℃保存待用。

2.2 P21、SIRT6、NF-κB mRNA 表達(dá)水平的測(cè)定按照總RNA 提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取上述肝組織總RNA，并計(jì)算RNA 純度和濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后以cDNA 為模板按熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Realtime-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，以β-actin 為內(nèi)參，以相對(duì)表達(dá)量（2-△△CT）方法計(jì)算肝組織中P21、SIRT6、NF-κB mRNA 表達(dá)水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件包進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，計(jì)量資料采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

采用高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD 模型小鼠，分別在第8、16、24 周觀察肝組織SIRT6、NF-κB、P21 mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在造模第8 周時(shí)模型組SIRT6 mRNA 表達(dá)較正常組同期明顯增高（P＜0.05），16 周時(shí)較正常組同期有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而24 周時(shí)則較正常組同期明顯下降（P＜0.05）；模型組小鼠肝組織NF-κB mRNA 表達(dá)隨造模時(shí)間增加而稍有增強(qiáng)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模第8 周，模型組P21 mRNA 表達(dá)與正常組同期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在造模第16 周和24 周則較正常組同期顯著增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 高脂誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠肝組織衰老相關(guān)基因mRNA 表達(dá)（）

表1 高脂誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠肝組織衰老相關(guān)基因mRNA 表達(dá)（）

注：正常組給予普通飼料喂養(yǎng)；模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)；P21 為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A；SIRT6 為沉默信息細(xì)節(jié)因子6；NF-κB 為核轉(zhuǎn)錄因子κB；β-actin 為β-肌動(dòng)蛋白；與正常組同期比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

4 討論

NAFLD 聚集著肝細(xì)胞衰老現(xiàn)象，其肝細(xì)胞有端粒過(guò)早縮短、細(xì)胞核增大、P21 表達(dá)增加、細(xì)胞周期停滯等細(xì)胞衰老表現(xiàn)；正常肝臟中，肝細(xì)胞端粒長(zhǎng)度不會(huì)發(fā)生改變，在慢性肝炎和肝硬化中，肝細(xì)胞出現(xiàn)端?？s短和衰老表現(xiàn)，而組織區(qū)域內(nèi)其他細(xì)胞，如肝淋巴細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞（HSC）未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用高脂飲食誘導(dǎo)建立NAFLD 模型小鼠，分別在8、16、24 周觀察肝組織P21 mRNA 表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P21 mRNA 在高脂16 周和24 周則較同期正常組顯著增強(qiáng)，提示肝細(xì)胞衰老發(fā)生聚集。

SIRT6 是近年來(lái)研究衰老的熱點(diǎn)[6]。NF-κB 是SIRT6 的下游調(diào)控分子，研究發(fā)現(xiàn)SIRT6 可與NFκB RELA 亞單位結(jié)合，促進(jìn)NF-κB 靶基因啟動(dòng)子H3K9 脫乙酰作用而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞增殖分化和抗細(xì)胞衰老的功能[7]。研究已證實(shí)SIRT6 可抑制NF-κB表達(dá)起到對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞、造血干細(xì)胞、心肌細(xì)胞的抗衰老作用[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，在NAFLD 進(jìn)展過(guò)程中，SIRT6 mRNA 在疾病早期（造模8 周）較正常組同期上調(diào)，而后期（造模24 周）則較正常組同期顯著下調(diào)，其疾病早期的上調(diào)，考慮NAFLD 小鼠為了抵抗氧化應(yīng)激，代償性增高。隨著疾病的進(jìn)展，SIRT6 基因的表達(dá)逐漸受到抑制，在后期顯著下降。NF-κB mRNA 在本實(shí)驗(yàn)中隨著造模時(shí)間增加而稍有增強(qiáng)，但均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），我們推測(cè)NF-κB 基因，受多因素調(diào)控，在NAFLD 肝細(xì)胞的衰老中并不是主要激活路徑。

隨著NAFLD 進(jìn)展，出現(xiàn)肝細(xì)胞衰老聚集現(xiàn)象，SIRT6 在疾病進(jìn)展中出現(xiàn)特征性的先升高后降低趨勢(shì)，與NAFLD 疾病的發(fā)展機(jī)制相一致，由此我們推測(cè)，肝細(xì)胞衰老參與NAFLD 進(jìn)程，SIRT6 基因在肝細(xì)胞衰老過(guò)程中起著重要作用。因此，通過(guò)干預(yù)SIRT6 基因，阻遏肝細(xì)胞衰老，可能成為NAFLD 治療的潛在靶點(diǎn)。