趙領(lǐng)娣，孫鐵強(qiáng)，劉文濤，賀鴻偉，董博偉，張迎春，秦天悅，寧保安，李雙，彭媛，韓殿鵬，崔建升，高志賢，*

（1.河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津300050）

沙丁胺醇（salbutamol，SAL），是一種短效 β-2 腎上腺素能受體激動(dòng)劑，最初用于緩解哮喘和慢性阻塞性肺病等疾病中的支氣管痙攣。然而，當(dāng)使用劑量為治療劑量的5倍～10倍時(shí)，沙丁胺醇可以通過(guò)減少脂肪沉積和增強(qiáng)蛋白質(zhì)含量來(lái)提高生長(zhǎng)速率和提高飼喂效率；因此，它在養(yǎng)殖業(yè)和其他相關(guān)農(nóng)業(yè)中被許多商人非法使用以增加瘦肉產(chǎn)量，并且在動(dòng)物體內(nèi)富集[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)β-2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑如沙丁胺醇的攝入，會(huì)增加自閉癥的風(fēng)險(xiǎn)[4]；導(dǎo)致肌纖維肥大，甚至在一定劑量下導(dǎo)致肌肉細(xì)胞死亡[5]；沙丁胺醇的微量吸入會(huì)降低血氧飽和度[6]等。農(nóng)業(yè)部公告明確指出沙丁胺醇是一種禁用藥物，不應(yīng)該在食物或水中檢出[7]。因此建立對(duì)沙丁胺醇的超靈敏檢測(cè)技術(shù)尤為重要。

針對(duì)沙丁胺醇的檢測(cè)，目前已發(fā)展多種基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法?；贑dSe量子點(diǎn)（quantum Dot，QD）電化學(xué)發(fā)光（electro-chemiluminescence，ECL）競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定法[8]，基于免疫磁珠和氧化石墨烯/金納米粒子混合基質(zhì)的表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)[9]，基于三聚氰胺探針功能化的金納米粒子比色檢測(cè)方法[10]，基于碳納米管的電化學(xué)檢測(cè)方法，并通過(guò)差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）測(cè)量評(píng)估該沙丁胺醇的電化學(xué)傳感性能[11]?；诰植勘砻娴入x子體共振（localized surface plasmon resonance，LSPR）傳感的無(wú)標(biāo)記無(wú)試劑免疫法[12]等等。然而，這些檢測(cè)方法靈敏度不足或設(shè)計(jì)復(fù)雜，限制了它們的開發(fā)和廣泛應(yīng)用。

DNA分子由于其強(qiáng)大的序列可編程性和準(zhǔn)確的分子識(shí)別能力而被廣泛用于生物傳感[13]。目前有許多信號(hào)放大策略來(lái)開發(fā)基于DNA的敏感生物傳感器[14]。其中20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）已成為一種成熟的擴(kuò)增技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基因檢測(cè)。在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上，同步實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增和定量，具有高靈敏性，特異性[15-16]。在DNA walker和折紙技術(shù)等不同的生物傳感策略中，必須設(shè)計(jì)獨(dú)特的DNA分子序列以產(chǎn)生獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)[17]。在本研究中，利用基于橋接DNA的鄰近連接技術(shù)的普通ssDNA實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。

Cheng-ting Tsai等[18]利用抗體的雙價(jià)識(shí)別抗原的能力，設(shè)計(jì)基于抗原抗體特異性識(shí)別和連接酶特異性識(shí)別的原理，從而構(gòu)建低背景值的高效DNA信號(hào)放大傳感器。這些傳感器利用兩個(gè)DNA連接的抗原分子與同一抗體分子結(jié)合，誘導(dǎo)短DNA結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)雜交，形成全長(zhǎng)擴(kuò)增子，通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行信號(hào)放大。在性質(zhì)上與鄰近連接實(shí)驗(yàn)類似，通過(guò)抗體的多價(jià)結(jié)合驅(qū)動(dòng)抗原DNA偶聯(lián)物的凝集，抗原可以是小分子[19]、蛋白質(zhì)[18]、外泌體[20]等任何可以與DNA做連接的物質(zhì)。該方法不需要復(fù)雜的DNA設(shè)計(jì)，在顯著降低其背景值的同時(shí)具有較高的靈敏度。

本研究結(jié)合免疫磁珠、橋接DNA-DNA連接酶介導(dǎo)的DNA融合技術(shù)構(gòu)建了一種高靈敏檢測(cè)沙丁胺醇的方法，該檢測(cè)方法有效的降低背景值，提高了靈敏度，在環(huán)境、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

TGL-16C離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DYY-11型電泳儀：北京六一儀器廠；IQ350凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)GE公司；OSE-96干式恒溫金屬?。罕本┨旄萍加邢薰?；MS3 Basic渦旋振蕩器：德國(guó)IKA公司；GNP-9050BS恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；MyGo Pro實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：IT-IS Life Science Ltd。

1.1.2 主要試劑

沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品（SAL）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：美國(guó) Sigma-Aldrich 公司；沙丁胺醇多克隆抗體（B180517）：北京博爾西科技有限公司；Dynabeads抗體偶聯(lián)試劑盒：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；磁珠封閉液：百邁格生物公司；PBST緩沖液（含0.05%Tween 20）：北京索萊寶生物科技有限公司；DNA連接酶（A8101）：美國(guó)Epicentre生物技術(shù)公司；qPCR kit：上海星漢生物科技有限公司；超純水（＞18.0 MΩcm）。所有DNA樣品均由上海生工生物工程有限公司合成（經(jīng)HPLC純化），核酸序列見表1。

表1 試驗(yàn)所用核酸序列Table 1 DNA sequences used in this study

1.2 方法

該方法首先將磁珠偶聯(lián)抗體形成免疫磁珠IAb。同時(shí)設(shè)計(jì)了一對(duì)寡核苷酸探針DNA1、DNA2，每個(gè)寡核苷酸鏈由40 nt堿基組成。使用SMCC連接方法，將SAL-BSA與3'SH游離末端DNA寡核苷酸（DNA 1）偶聯(lián)以制備SAL探針1與5'SH游離末端DNA寡核苷酸（DNA 2）偶聯(lián)制備SAL探針2，兩個(gè)寡核苷酸探針同時(shí)與同一抗體分子結(jié)合，使兩個(gè)探針進(jìn)入相同的復(fù)合物分子，顯著增加探針兩個(gè)短序列的局部有效濃度。然后，這兩個(gè)短序列經(jīng)過(guò)與橋接DNA（bridge）堿基互補(bǔ)配對(duì)、在特異性DNA連接酶的作用下形成80 nt全長(zhǎng)擴(kuò)增子，即AbD的橋聯(lián)結(jié)構(gòu)。通過(guò)磁分離將AbD結(jié)構(gòu)分離，進(jìn)一步降低背景值。之后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大并進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1 免疫磁珠的制備。

準(zhǔn)確稱取5 mg的M270磁珠粉末（磁珠直徑2.8 μm）放入1.5 mL離心管內(nèi)，使用C1溶液洗滌后加入 20 μL（2.3 mg/mL）的兔多抗，再加入 230 μL 的 C1溶液和C2溶液250 μL至總體積500 μL。置于垂直混旋儀中37℃孵育20 h。加入緩沖液多次洗脫后加入500磁珠封閉液室溫（25℃）4 h后重懸在500 μL緩沖體系中，在4℃下儲(chǔ)存供下一步使用。

1.2.2 DM探針的制備

取 60 μL sulfo-SMCC的 HEPES緩沖液稀釋（7.5 nmol/L），加入20 μL 沙丁胺醇-OVA（10 mg/mL 約222 nmol/L），避光反應(yīng) 30 min。加 20 μL HS-DNA（10 μmol/L）溶液，4℃過(guò)夜。使用30 kDa超濾管10 000 r/min 離心 1 次，2 min/次。

1.2.3 檢測(cè)方法的建立

取免疫磁珠儲(chǔ)備溶液、探針1、2各5 μL體積加入一個(gè)1.5 mL離心管中，加入PBST至50 μL，其中探針濃度為10 nmol/L，將混合物在37℃孵育30 min，并用100 μL 0.05%PBST洗滌兩次。重懸到120 μL含有連接酶、橋接DNA的連接緩沖體系中（20 mmol/L Tris，25 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，7.5 mmol/L DTT，0.5 μmol/L NAD，0.021 U/μL ligase，100 nmol/L bridge oligo，0.01%TritonX-100，pH 8.0），在 30℃下孵育15 min。并用130 μL 0.05%PBST洗滌兩次。磁分離，PBST洗滌2次3 min/次，磁分離1 min。重懸在50 μL體系中作為模板。在10 μL qPCR Master mix中加入上下游引物（5 μmol/L）各 0.5 μL，同時(shí)加入 5 μL 模板，加入ddH2O制備20 μL體系。qPCR系統(tǒng)程序設(shè)置（95℃：300 s；95 ℃：10 s；60 ℃：30 s；72 ℃：30 s；45 T）。

1.2.4 特異性

應(yīng)用濃度為1 ng/mL的沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、苯氧丙酚胺、克侖特羅對(duì)1.2.3建立的方法進(jìn)行特異性檢驗(yàn)。

1.2.5 模擬實(shí)際樣品檢測(cè)

將沙丁胺醇按500、5 000、10 000 pg/mL依次分別加入到自來(lái)水、人工尿液中，應(yīng)用1.2.3建立的方法進(jìn)行回收檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 可行性分析

成功偶聯(lián)抗體與磁珠、抗原與DNA之后首先對(duì)試驗(yàn)的可行性進(jìn)行了驗(yàn)證，加入免疫磁珠與只加入磁珠的對(duì)照組相比，前者具有更低的Ct值，與對(duì)照組差異明顯，證明該方案可以通過(guò)加入不同濃度的沙丁胺醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合免疫磁珠而產(chǎn)生不同的Ct值實(shí)現(xiàn)對(duì)沙丁胺醇的定量檢測(cè)。

2.2 條件優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)用于小分子檢測(cè)的生物傳感器的最佳性能，優(yōu)化了免疫磁珠濃度及橋接長(zhǎng)度。兩條連接小分子的寡核苷酸鏈在免疫磁珠的作用下與bridge雜交是AbD的獨(dú)特之處。首先對(duì)bridge的連接作用進(jìn)行了測(cè)試。設(shè)計(jì)了 20、18、16、14、12nt bridge 5 個(gè)優(yōu)化長(zhǎng)度，見圖1。

圖1 不同橋接長(zhǎng)度DNA自誘導(dǎo)連接的能力測(cè)定Fig.1 Determination of the ability of DNA to self-induced ligation of different bridging lengths

選用不同長(zhǎng)度bridge，在高濃度DNA探針存在并且不加IAb時(shí)，可以通過(guò)自身高碰撞率，分子間親和力結(jié)合在一起，bridge序列越長(zhǎng)，連接作用越大，進(jìn)行qPCR的模板越多，產(chǎn)生的Ct值越小。16、14、12nt的長(zhǎng)度下產(chǎn)生的Ct值接近0nt（背景對(duì)照）產(chǎn)生的Ct值，表明bridge長(zhǎng)度在16nt時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期，連接能力幾乎為零。我們使用20、18、16nt序列長(zhǎng)度做進(jìn)一步優(yōu)化，將免疫磁珠調(diào)整為能形成AbD的橋聯(lián)結(jié)構(gòu)的最適比例，防止DNA高濃度后的自連接。一個(gè)抗體可能同時(shí)連接兩個(gè)5'端修飾小分子DNA、或兩個(gè)3'端修飾小分子DNA，這都是不希望出現(xiàn)的結(jié)合，不能形成AbD結(jié)構(gòu)。優(yōu)化抗體濃度及反應(yīng)體系的大小避免這種潛在問(wèn)題的出現(xiàn)。

免疫磁珠濃度梯度依次為 6、60、600、6 000 ng/mL及控制組。同一抗體濃度下加入不同長(zhǎng)度的bridge，觀察Ct值變化，見如圖2。

圖2 在不同橋接長(zhǎng)度下不同免疫磁珠濃度的Ct值響應(yīng)Fig.2 The Ct value response for different immunomagnetic bead concentrations at different bridge lengths

更長(zhǎng)的bridge有更高的結(jié)合效率，Ct值越小，表明增加bridge長(zhǎng)度增強(qiáng)了所需AbD的形成。如果莖序列太長(zhǎng)，它們可以在不存在與靶標(biāo)結(jié)合的抗體的情況下自發(fā)地雜交在一起，這種分子間雜交會(huì)降低檢測(cè)靈敏度?？乖贵w之間存在一個(gè)最佳結(jié)合濃度，抗原抗體任何一個(gè)濃度增大，都會(huì)抑制二者之間的結(jié)合?？贵w濃度為60 ng/mL時(shí)，產(chǎn)生的Ct值最小，效果最佳。綜上，該體系的最佳反應(yīng)條件：抗體濃度60 ng/mL、bridge 長(zhǎng)度 20nt。

2.3 方法性能

利用本方法檢測(cè)不同濃度的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品。將具有不同濃度的SAL添加到反應(yīng)系統(tǒng)中以確定在優(yōu)化條件下的檢測(cè)范圍和靈敏度，結(jié)果如圖3所示。

圖3 檢測(cè)不同濃度沙丁胺醇工作曲線Fig.3 Linear calibration curves for detection of RT in different concentration

隨著小分子濃度的增加，傳感器的Ct值逐漸增大?；贑t值的響應(yīng)，獲得具有在1.0×10-2ng/mL～1.0×103ng/mL范圍內(nèi)的良好線性關(guān)系的校準(zhǔn)曲線，線性方程為 y=0.826lg（x）+24.29，相關(guān)系數(shù)（R2）為 0.999 2。在與分析實(shí)際樣品完全相同的條件下，做不加入被測(cè)組分的重復(fù)測(cè)定即空白試驗(yàn)。根據(jù)空白值的平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算SAL的檢出限（LOD）為1.2×10-2ng/mL。該方法具有檢測(cè)范圍寬、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

2.4 特異性檢測(cè)

為了測(cè)試該方法的特異性，選擇沙丁胺醇的結(jié)構(gòu)、功能類似物萊克多巴胺、特布他林、苯氧丙酚胺、克侖特羅作為對(duì)照物。其特異性檢測(cè)結(jié)果見圖4。

2.5 樣品加標(biāo)模擬檢測(cè)

圖4 方法的選擇性Fig.4 Specificity test of this method

采用本方法檢測(cè)自來(lái)水及人工尿液樣品中的沙丁胺醇。自來(lái)水及人工尿液分別首先在10 000 r/min下離心5 min，取上清液，然后加入一定濃度的沙丁胺醇進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2。

表2 自來(lái)水和人工尿液中沙丁胺醇加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 2 Recoveries of RT in tap water and artificial urine samples（n=3）

加標(biāo)回收率在87.1%～111.7%之間，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差/計(jì)算結(jié)果的算術(shù)平均值得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜5.1%，表明本方法靈敏度較高，準(zhǔn)確性較好，可用于自來(lái)水和尿液實(shí)際中沙丁胺醇的的檢測(cè)。

3 結(jié)論

構(gòu)建了一種基于免疫磁珠、橋接DNA-DNA連接酶介導(dǎo)的DNA融合技術(shù)構(gòu)建了一種高靈敏檢測(cè)沙丁胺醇的方法，通過(guò)抗體特異性識(shí)別兩個(gè)鄰位連接探針在橋接DNA的作用下，形成全長(zhǎng)擴(kuò)增子，以此為模板擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，沙丁胺醇的檢出限為1.2×10-2ng/mL，用于自來(lái)水及尿液中沙丁胺醇的檢測(cè)，效果良好。本方法操作簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的DNA設(shè)計(jì)；線性范圍寬、靈敏度高。本方法適用于任何可以與DNA連接的抗原物質(zhì)，對(duì)于其它目標(biāo)物的檢測(cè)具有一定的借鑒和參考價(jià)值。