張守花，許真，蔣安，王永剛

（鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鶴壁458030）

硒是人體必需的微量元素之一，在合成硒代半胱氨酸時，作為酶結(jié)構(gòu)上的一部分[1]，具有清除自由基、抗氧化、抗癌和提高機(jī)體免疫力的作用[2]。人體的多種疾病與缺硒有關(guān)，如克山病、癌癥等[3]。我國大部分地區(qū)處于缺硒地帶[4]，成人每天攝入的硒元素量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生物需要量[5]。很多研究已證實(shí)，食用含有豐富植物素的植物對人體健康因子的激發(fā)具有促進(jìn)作用。人類的健康和植物營養(yǎng)之間具有顯著地正向關(guān)系，很多植物需要的基本營養(yǎng)成分同樣也被人類和動物需要，多數(shù)情況下，具有相似的作用機(jī)理[1]，因此，提高作物中硒元素的含量是人體補(bǔ)硒最安全經(jīng)濟(jì)的方法。

草莓（Fragaria ananassa Duch）是薔薇科草莓屬多年生草本漿果植物，鮮嫩多汁，營養(yǎng)豐富，其抗氧化能力是蘋果、柑橘等園藝作物的2倍～11倍[6]。草莓果實(shí)中抗氧化物質(zhì)對人類健康的影響越來越受到關(guān)注，抗氧化活性也成為衡量其果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[7]。

迄今為止，有關(guān)硒肥對草莓果實(shí)的抗氧化活性及相關(guān)物質(zhì)含量的影響尚未見報道。本試驗通過對開花期草莓施用不同濃度的亞硒酸鈉（Na2SeO3）溶液，對其果實(shí)中總硒含量和抗氧化活性及相關(guān)物質(zhì)含量進(jìn)行測定，以期為提高草莓品質(zhì)，生產(chǎn)高抗氧化活性的草莓提供科學(xué)合理的施硒方法，為生產(chǎn)富硒果蔬提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草莓：品種為“章姬”“紅顏”，本地栽培。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：上海如吉生物科技有限公司；福林-酚試劑：上海躍騰生物科技有限公司；硝酸（優(yōu)級純）、亞硒酸鈉、FeSO4、水楊酸、香草醛、亞硝酸鈉、2，6-二叔丁基對甲酚（2，6-di-tertbutyl-4-methyl phenol，BHT）、鄰苯三酚、甲醇（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2000型紫外分光光度計：上海尤尼可儀器有限公司；AFS-920型雙道原子熒光光譜儀：北京吉天儀器有限公司；Agilent 1290 InfinityⅡLC型色譜儀：安捷倫公司；TP-114電子分析天平：賽多利斯儀器有限公司；TGL-16gR型臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 草莓栽培

試驗在本地大棚內(nèi)進(jìn)行。2016年9月10日選取3葉1心生長健壯，整齊一致的草莓苗進(jìn)行定植，起壟栽培，每壟2行，行距為40 cm，株距為25 cm。待草莓長至初花期，開始進(jìn)行葉面噴施亞硒酸鈉溶液，同時設(shè)清水噴施為對照（CK），噴施程度以葉面均勻布滿霧狀溶液為標(biāo)準(zhǔn)。試驗選擇硒濃度為 0（CK）、5、10、15、20、25 mg/L共6個處理，每個處理20株，3次重復(fù)。每隔10 d噴施一次，直至初果期（果實(shí)顏色為綠色）停止噴施。

1.3.2 樣品預(yù)處理

選取果實(shí)發(fā)育充分，著色面積達(dá)到90%左右，大小基本一致，無病蟲害，無機(jī)械傷的果實(shí)采收。取不同處理的果實(shí)，清洗后切碎，在液氮中快速冷凍，用封口袋包裝，置于-18℃冰箱中保存，用于硒、抗氧化活性、總酚、原花青素、總黃酮、維生素C和維生素E的含量測定。

1.3.3 測定方法

1.3.3.1 總硒含量測定

稱取5 g樣品于微波消解管中，加入16 mL硝酸，消化過夜，用微波消解儀消解。將消解液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，用高純水定容，濾紙過濾，取10 mL濾液，加入2.5 mL HCl，沸水浴2 h，用熒光光譜儀測定總硒含量。每份樣品平行測定3次，取平均值[8]（下同）。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率的測定

取草莓汁2 mL，加入0.1 mg/mL DPPH溶液2 mL，混勻，放置30 min，在517 nm處測A樣品吸光光度值，計算清除率[9]。

DPPH 自由基清除率/%=（A空白-（A樣品-A對照）/A空白）×100

式中：A樣品為樣液與DPPH溶液混合后的吸光光度值；A對照為樣液與溶劑混合后的吸光光度值；A空白為溶劑與DPPH溶液混合后的吸光光度值。

1.3.3.3 OH自由基清除率的測定

依次加入6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、草莓汁各2 mL，混勻，加入6 mmol/L H2O2溶液2 mL，混勻，放置15 min，在510 nm處測A樣品吸光光度值，計算清除率[9]。

OH 自由基清除率/%=（A空白-（A樣品-A對照）/A空白）×100

式中：A樣品為樣液加H2O2的吸光光度值；A對照為樣液未加H2O2的吸光光度值；A空白為空白液的吸光光度值。

1.3.3.4 O2-自由基清除率的測定

取0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL，加入1 mL草莓汁和25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.5 mL，25℃水浴反應(yīng)4 min，加入8 mol/L HCl溶液0.5 mL，320 nm處測A樣品吸光光度值，計算清除率[9]。

O2-自由基清除率/%=（A空白-（A樣品-A對照）/A空白）×100

式中：A樣品為樣液加鄰苯三酚的吸光光度值；A對照為樣液未加鄰苯三酚的吸光光度值；A空白為空白液的吸光光度值。

1.3.3.5 總酚含量測定

去籽草莓果肉打漿、離心，取草莓汁，加4倍蒸餾水稀釋。精確量取稀釋后的樣品溶液0.5 mL，加30 mL蒸餾水混勻，加入2.5 mL福林酚試劑，7.5 mL20%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至50 mL，混勻，75℃水浴10 min，冷卻后在760 nm處測其吸光度[10]。

1.3.3.6 原花青素含量測定

凍干樣品粉碎，加入80%甲醇溶液，28℃振蕩24h，4 000 r/min離心10 min，取上清液過濾，裝于棕色瓶，-4℃保存，待用。用錫箔紙將試管包嚴(yán)，僅留管口用于加樣。取上清液1 mL，加入40 g/L香草醛甲醇溶液6 mL，再加入3 mL濃鹽酸，混勻，室溫25℃條件下，暗處放置15 h，在500 nm波長處比色[11]。

1.3.3.7 總黃酮含量測定

凍干樣品粉碎，加入80%甲醇溶液，28℃振蕩24 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液過濾。取濾液10 mL與1 mL 50 g/L亞硝酸鈉溶液混合，5 min后加入100 g/L六水氯化鋁1 mL，混勻，反應(yīng)5 min后，再加入1 mol/L氫氧化鈉10 mL，充分混勻，15 min后在510 nm波長處測定吸光度[12]。

1.3.3.8 維生素C含量測定

取去籽草莓果肉5.0 g，研磨均勻置于錐形瓶中，加入2%偏磷酸溶液10 mL，塞緊瓶口，30℃，超聲輔助提取30 min，加入10 mL蒸餾水，13 000 r/min下離心10 min，取上清液2 mL加蒸餾水定容至10 mL，在246 nm處測定吸光度[13]。

1.3.3.9 維生素E含量測定

取少量去籽草莓果肉，研磨細(xì)碎后取0.1 g，加入含0.01%BHT的甲醇∶氯仿（2∶1，體積比）混合液2 mL，避光靜置20 min，然后加入0.8 mL氯仿和1.5 mL水，振蕩混勻，13 000 r/min下離心15 min，取下層蒸干，用二氯甲烷∶甲醇（1∶5，體積比）的混合液溶解至800 μL，置于樣品瓶中上機(jī)測定，進(jìn)樣量20 μL。色譜柱為 Li-CHrospher 100 Diol 250 mm×4 mm，粒徑 5 μm；流動相，甲醇 ∶水（97∶3，體積比）；流速 1.2 mL/min；熒光激發(fā)292 nm，發(fā)射330 nm[14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用Microsoft Excel 2007繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硒處理濃度對草莓果實(shí)中總硒含量的影響

植物在一定硒濃度范圍內(nèi)，對硒的吸收能力隨硒濃度的增加而增大，但施硒過量時，植物體富硒能力下降，嚴(yán)重時會對植物體造成不同程度的傷害[15]。不同硒濃度處理對草莓果實(shí)中總硒含量的影響見圖1。

圖1 不同硒濃度處理對草莓果實(shí)中總硒含量的影響Fig.1 Effect of different selenium treatments on selenium content of strawberry

由圖1可知，清水（CK）噴施時，果實(shí)中硒含量非常低，隨著硒濃度的增加，“章姬”“紅顏”果實(shí)中硒含量都呈明顯上升趨勢，當(dāng)硒濃度為20 mg/L時，果實(shí)中的硒富集量分別為 35.32、40.12 μg/kg，達(dá)最大值；硒濃度為25 mg/L時，果實(shí)中硒含量幾乎沒有變化，說明果實(shí)對硒的吸收能力已達(dá)飽和狀態(tài)。由此可見，提高硒處理濃度對草莓果實(shí)中硒的積累是有積極作用的，草莓對外源硒的吸收具有飽和性。

“紅顏”對硒的富集能力高于“姬章”，可能是因為品種間的差異性。

2.2 不同硒處理濃度對草莓果實(shí)抗氧化活性的影響

研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）能清除生物體內(nèi)過多自由基，而硒對該酶具有活性調(diào)節(jié)作用[16]。不同硒濃度處理的草莓對自由基的清除作用如圖2～圖4所示。

圖2 不同硒濃度處理的草莓對DPPH自由基的清除作用Fig.2 DPPH radical-scavenging capability of strawberry by different selenium treatments

圖3 不同硒濃度處理的草莓對OH自由基的清除作用Fig.3 OH radical-scavenging capability of strawberry by different selenium treatment

圖4 不同硒濃度處理的草莓對O2-自由基的清除作用Fig.4 O2-radical-scavenging capability of strawberry by different selenium treatments

由圖2～圖4可以看出，隨著硒濃度的增加，“章姬”“紅顏”對自由基的清除率均比對照增加。硒濃度為 20 mg/L 時，“章姬”對 DPPH·、·OH、O2-·3 種自由基的清除率達(dá)最大值，分別為85.09%、58.94%和63.3%；“紅顏”對3種自由基的清除率也達(dá)最大值，分別為90.17%、66.87%和70.04%。硒濃度為25 mg/L時，兩品種對自由基的清除率不再有顯著變化，說明對草莓果實(shí)噴施適宜濃度的硒溶液，可以增加其對自由基的清除能力，但草莓對硒的吸收具有飽和性，達(dá)到一定程度后，抗氧化能力將不再增加。究其原因，主要是硒作為一種誘發(fā)因子，以硒代半胱氨酸或硒代甲硫氨酸的形式參與到GSH-Px的結(jié)構(gòu)中，激活GSH-Px合成的相關(guān)基因，從而提高酶的活性，但隨著硒濃度的增加，植物體內(nèi)GSH-Px合成達(dá)到飽和，再增加硒濃度，酶活性也不再增加，自由基清除率也就不再變化[17]。由于品種間差異，對硒的吸收能力及自身抗氧化物質(zhì)含量不同造成施硒后“紅顏”對自由基的清除率高于“章姬”。

2.3 不同硒處理濃度對草莓果實(shí)抗氧化物質(zhì)含量的影響

不同硒濃度處理對草莓果實(shí)中抗氧化物質(zhì)含量的影響如表1所示。

2.3.1 對總酚含量的影響

酚類物質(zhì)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，有效抑制或清除活性氧自由基，起到抗氧化作用[18]。噴施硒溶液后，草莓果實(shí)中的總酚含量隨硒濃度的增加而逐漸升高。如表 1 所示，與對照相比，5、10、15、20 mg/L和25 mg/L的處理均能顯著提高果實(shí)中的總酚含量，硒濃度為20 mg/L時，“章姬”“紅顏”果實(shí)中的總酚含量均達(dá)最大值，分別為298.7 mg/100 g和295.3 mg/100 g，比對照提高了9.5%和12.7%，差異顯著。這是因為苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）是連接初級代謝和苯丙烷、苯丙氨酸類代謝的關(guān)鍵酶，參與酚類物質(zhì)的合成，PAL活性增高，酚類物質(zhì)含量呈一致性增加[19]。由于PAL活性與植物體中硒含量有極顯著的正相關(guān)性[20]，隨著果實(shí)中硒含量的增加，PAL活性逐漸增強(qiáng)，促進(jìn)果實(shí)中酚類物質(zhì)的合成和積累。

表1 不同硒濃度處理對草莓果實(shí)中抗氧化物質(zhì)含量的影響Table 1 Effect of different selenium treatments on antioxidant substances content of strawberry

2.3.2 對原花青素含量的影響

原花青素（proantho anthocyan，PA）又叫縮合單寧，是廣泛存在于高等植物界中的一類聚多酚化合物，具有強(qiáng)大的清除自由基、抗氧化能力[21]。由表1可知，隨著硒溶液濃度的增加，草莓果實(shí)中原花青素含量越來越高。與對照相比，“章姬”的原花青素含量分別增加1.2%、4.9%、6.6%、11.5%和9.4%，“紅顏”的原花青素含量分別增加2.3%、5.2%、8.9%、13.6%和11.4%。施硒濃度為20 mg/L時原花青素含量最高，“章姬”為22.33 mg/100 g，“紅顏”為23.41 mg/100 g，而25 mg/L處理時原花青素含量稍有降低，究其原因可能與原花青素合成途徑有關(guān)，原花青素合成經(jīng)歷公共苯丙烷途徑→核心類黃酮-花青素途徑→PA特異途徑[22]，而PAL是苯丙烷途徑的第一個關(guān)鍵酶，適量硒可以提高PAL的活性[20]，PAL活性增強(qiáng)，原花青素含量相應(yīng)增加。

2.3.3 對總黃酮含量的影響

草莓果實(shí)中總黃酮的含量隨硒溶液濃度的增加而升高，硒濃度為20mg/L時，“章姬”“紅顏”的總黃酮含量均達(dá)最大值，分別為40.24 mg/100 g和44.59 mg/100 g，比對照提高了19.6%和24.4%；硒濃度為25 mg/L時，總黃酮含量呈下降趨勢，這可能是因為，黃酮類化合物由苯丙烷類代謝途徑產(chǎn)生，PAL催化苯丙烷類代謝的第一步，與黃酮類化合物的生成有密切關(guān)系。硒含量增加，PAL活性增強(qiáng)，總黃酮含量上升，硒過高時可能加快了其它次生代謝產(chǎn)物合成，不利于黃酮類物質(zhì)合成[20]。

2.3.4 對維生素C含量的影響

維生素C是一類存在于植物綠色組織中的水溶性抗氧化物質(zhì)，在清除自由基，提高植物抗脅迫能力方面具有重要意義[23]。維生素C含量隨施硒濃度變化動態(tài)如表1所示，隨著硒濃度的增加，果實(shí)中維生素C含量也逐漸升高，濃度為20 mg/L時達(dá)最大值，“章姬”為64.24 mg/100 g，比對照提高了18.7%；“紅顏”為84.43 mg/100 g，比對照提高了16.2%。這是因為硒被吸收后會形成硒蛋白能提高植物的合成代謝能力，使維生素C合成量增加；植物對硒的吸收具有飽和性，達(dá)到一定量后不再吸收，合成代謝能力隨之減弱，維生素C含量也相應(yīng)下降。

2.3.5 對維生素E含量的影響

維生素E又名生育酚，是一類由光合組織合成的脂溶性強(qiáng)抗氧化劑[24-25]，能減弱脂肪氧合酶對不飽和脂肪酸的傷害，清除生物體內(nèi)自由基，延緩衰老[26]。試驗結(jié)果表明，隨著硒溶液濃度升高，草莓果實(shí)中維生素E含量顯著提高，硒濃度為20 mg/L，“章姬”“紅顏”果實(shí)中的維生素E含量均達(dá)最大值，分別比對照提高了52.1%和100%；硒濃度為25 mg/L，分別比對照提高了47.3%和89.7%，與20 mg/L處理差異不顯著，說明適宜濃度的外源硒溶液對維生素E的合成具有促進(jìn)作用，這可能是因為硒元素能調(diào)控和促進(jìn)植物葉綠素的合成代謝，提高光合速率[27]，增強(qiáng)光合組織功能，維生素E由光合組織合成，硒元素通過對光合組織的積極作用間接促進(jìn)了維生素E的合成。

3 結(jié)論

本試驗考慮到硒素來源的毒性及對環(huán)境的影響，選擇了風(fēng)險性較小的亞硒酸鈉為外源硒素，并采用葉面噴施的方式，減少過量硒素對土壤和植物的危害。

由試驗結(jié)果可知，一定范圍內(nèi)，隨著硒濃度的增加，草莓對硒的吸收能力、抗氧化活性和抗氧化物質(zhì)含量呈上升趨勢。葉面噴施硒濃度為20 mg/L時，草莓對外源硒的富集力最強(qiáng)，對DPPH·、·OH、·O2-3種自由基的清除率最大，總酚、原花青素、總黃酮、維生素C、維生素E含量都顯著高于對照，硒濃度為25 mg/L時，草莓果實(shí)對硒的吸收能力、抗氧化活性和抗氧化物質(zhì)含量都沒有顯著增加，部分呈下降趨勢，因此，可噴施20 mg/L的硒溶液，提高草莓果實(shí)的抗氧化活性及相關(guān)物質(zhì)含量，提高草莓品質(zhì)，延長保質(zhì)期。