劉勝男，余敏敏，郭曉莉，潘菁菁，相啟森，*

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450001；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450001）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一類含有不成對(duì)電子的氧原子及原子團(tuán)，包括超氧陰離子（O2-）、羥自由基（·OH）和過氧化氫（H2O2）等[1]。研究顯示，機(jī)體過量產(chǎn)生的ROS會(huì)引發(fā)蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化和DNA氧化損傷等，進(jìn)而誘發(fā)人體多種疾病[2-3]。例如，胡靜等[4]研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可能會(huì)誘發(fā)天皰瘡，Ram等[5]發(fā)現(xiàn)ROS誘導(dǎo)的DNA氧化損傷與阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。為了降低氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體造成的損傷，一些天然抗氧化劑受到研究者的廣泛關(guān)注。研究證實(shí)，兒茶素、沒食子酸、植物多酚等具有較強(qiáng)的清除自由基能力及抗衰老、抗癌、消炎及抗氧化等功能[6-8]，能夠有效預(yù)防和減緩氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）是一種原產(chǎn)于地中海沿岸的天然香料植物，是目前廣泛應(yīng)用的食品添加劑[9]。迷迭香含有的迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸和鼠尾草酚等已被證實(shí)具有抗氧化、抗菌、消炎和抗腫瘤等生理活性功能，但是在生物大分子和油脂氧化損傷抑制作用方面的研究卻相對(duì)較少[9-12]。因此本研究通過Cu2+/H2O2、2，2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽[2，2'-azobis（2-amidinopropane）hydrochloride，AAPH]誘 導(dǎo)牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）氧化損傷，F(xiàn)eSO4、偶氮二異庚腈 [2，2'-azobis （2，4-di-methylvaleronitrile），AMVN]誘導(dǎo)亞油酸（linoleic acid，LA）氧化損傷以及AAPH誘導(dǎo)鯡魚精DNA（herring sperm DNA，hsDNA）氧化，研究在此過程中迷迭香提取物對(duì)氧化損傷的抑制作用，為迷迭香在抗氧化功能食品中的應(yīng)用提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

迷迭香提取物：食品營養(yǎng)與安全實(shí)驗(yàn)室自制；亞油酸（linoleic acid，LA）、2，2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH）和偶氮二異庚腈（AMVN）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、鯡魚精DNA（hsDNA）、考馬斯亮藍(lán)R-250：北京索萊寶科技有限公司；β-巰基乙醇、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、N，N'-亞甲雙丙烯酰胺、甘氨酸、N，N，N'，N'-四甲基二乙胺（TEMED）、異丙醇、三羥甲基氨基甲烷、溴酚藍(lán)、過硫酸銨和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：上海麥克林生化科技有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）：北京百靈威科技有限公司；CuSO4·5H2O、30%雙氧水、冰乙酸和 FeSO4·7H2O：天津市大茂化學(xué)試劑廠；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

PowerPacTM通用電泳儀電源、Mini-PROTEANTetra電泳槽、ChemiDocTMXRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；5427R型高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；2450型紫外-可見分光光度計(jì)：日本Shimadzu公司；HH-8J型恒溫水浴鍋：常州潤華電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 迷迭香提取物對(duì)Cu2+/H2O2誘導(dǎo)蛋白氧化和羰基化的影響

在終濃度為2 mg/mL的BSA溶液（pH6.0、0.2 mol/L PBS 溶解） 中加入 100 μL 不同濃度（0、25、50、100、200、500 μg/mL）的迷迭香提取物溶液，混勻后依次加入終濃度為400 μmol/L和10 mmol/L的CuSO4溶液和H2O2溶液，反應(yīng)總體積為1 mL，封口后置于37℃水浴反應(yīng)90 min。反應(yīng)結(jié)束后，采用10%分離膠進(jìn)行SDSPAGE分離蛋白，考馬斯亮藍(lán)R-250染色法進(jìn)行染色，檢測BSA氧化損傷程度，采用DNPH比色法檢測BSA羰基含量。

1.3.2 迷迭香提取物對(duì)AAPH誘導(dǎo)蛋白氧化和羰基化的影響

在終濃度為2 mg/mL的BSA溶液中加入100 μL不同濃度的迷迭香提取物溶液，混勻后加入終濃度為100 mmol/L的 AAPH 溶液（pH 7.4，PBS溶解），反應(yīng)總體積為1 mL，封口置于37℃水浴反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，測定BSA的氧化損傷程度和羰基含量。

1.3.3 BSA氧化損傷程度測定

取50 μL反應(yīng)樣品，分別加50 μL 5×上樣緩沖液混勻后沸水浴5 min，采用10%分離膠分離蛋白，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250溶液（1 g/L）染色30 min，脫色液脫色過夜，采用ChemiDocTMXRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像并使用Image Lab軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。

1.3.4 BSA羰基含量測定

取1 mL反應(yīng)液加入3 mL 0.01 mol/L DNPH溶液，混勻后于室溫（25℃）下避光反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后加入4 mL、20%TCA溶液，混勻后4 000 r/min離心10min。棄上清液后，加入3mL乙醇-乙酸乙酯混合液（體積比1∶1）進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次。最后一次離心后棄上清液，加入2 mL、6 mol/L鹽酸胍溶液，混勻后采用紫外-可見分光光度計(jì)測定其在370 nm處吸光值。蛋白羰基含量（nmol/mg）使用摩爾吸光系數(shù)22 000 mol/（L·cm）來計(jì)算。

1.3.5 迷迭香提取物對(duì)FeSO4誘導(dǎo)亞油酸氧化的影響

在終濃度為1 mmol/L的LA（乙醇溶解）中，加入100 μL不同濃度的迷迭香提取物溶液，混勻后再加入終濃度為100 μmol/L的FeSO4溶液，反應(yīng)總體積為1 mL，封口后于37℃水浴避光反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，以共軛二烯和MDA含量表示亞油酸脂質(zhì)氧化水平。參照Esterbauer等報(bào)道的方法檢測共軛二烯含量[13]。用紫外-可見分光光度計(jì)測定樣品在233 nm處的吸光度，并根據(jù)共軛二烯的摩爾吸光系數(shù)2.8×104L/（mol·cm）計(jì)算共軛二烯含量，結(jié)果以μmol/L表示。采用MDA試劑盒測定樣品中MDA含量，結(jié)果表示為nmol/mL。

1.3.6 迷迭香提取物對(duì)AMVN誘導(dǎo)亞油酸氧化的影響

在終濃度為1 mmol/L的LA中，加入100 μL不同濃度的迷迭香提取物溶液，混勻后再加入終濃度為1 mmol/L的AMVN溶液（甲醇溶解），反應(yīng)總體積為1 mL，封口后于37℃水浴避光反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，以共軛二烯和MDA含量為指標(biāo)評(píng)價(jià)亞油酸脂質(zhì)氧化水平。

1.3.7 迷迭香提取物對(duì)AAPH誘導(dǎo)DNA氧化損傷的影響

在終濃度為2 mg/mL的hsDNA（pH6.0、0.2 mol/L PBS溶解）中，加入100 μL不同濃度的迷迭香提取物溶液，再加入終濃度為40 mmol/L的AAPH溶液，反應(yīng)總體積為1 mL，混勻后于37℃恒溫水浴12 h。采用南京建成研究所MDA試劑盒測定hsDNA氧化損傷水平，并根據(jù)公式（1）計(jì)算迷迭香提取物對(duì)AAPH誘導(dǎo)MDA生成的抑制率：

式中：A0為空白組（不加誘導(dǎo)劑和迷迭香提取物）的吸光度；A1為誘導(dǎo)組的吸光度；A2為同時(shí)加入迷迭香提取物和誘導(dǎo)劑后的吸光度。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，最小顯著差異法（least significant difference，LSD）進(jìn)行顯著性分析，p<0.05表示差異顯著，采用GraphPad Prism 7.0繪圖軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 迷迭香提取物對(duì)Cu2+/H2O2誘導(dǎo)蛋白氧化的影響

迷迭香提取物對(duì)Cu2+/H2O2誘導(dǎo)BSA氧化的影響見圖1。

圖1 迷迭香提取物對(duì)Cu2+/H2O2誘導(dǎo)BSA氧化的影響Fig.1 Effect of rosemary extract on oxidative damage of BSA induced by Cu2+/H2O2

由圖1A可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)Cu2+/H2O2誘導(dǎo)后，試驗(yàn)組BSA條帶顏色明顯變淺；與模型組相比，隨著迷迭香提取物濃度的增加，BSA條帶顏色明顯變深。由圖1B可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)Cu2+/H2O2誘導(dǎo)后，試驗(yàn)組BSA條帶相對(duì)灰度顯著降低（p＜0.05）；與模型組相比，BSA條帶相對(duì)灰度隨迷迭香提取物濃度的增加而顯著升高（p＜0.05），該結(jié)果與張?jiān)碌萚14]研究結(jié)果相一致。出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是，Cu2+/H2O2能夠通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基誘導(dǎo)BSA發(fā)生氧化降解，從而造成蛋白條帶灰度降低，而迷迭香提取物含有的多酚類物質(zhì)能夠清除羥自由基，從而抑制蛋白氧化降解[15]。

2.2 迷迭香提取物對(duì)AAPH誘導(dǎo)蛋白氧化的影響

迷迭香提取物對(duì)AAPH誘導(dǎo)BSA氧化的影響見圖2。

圖2 迷迭香提取物對(duì)AAPH誘導(dǎo)BSA氧化的影響Fig.2 Effect of rosemary extract on oxidative damage of BSA induced by AAPH

如圖2所示，與對(duì)照組相比，AAPH處理組BSA條帶顏色變淺，BSA條帶相對(duì)灰度顯著降低（p＜0.05）；與模型組相比，BSA條帶相對(duì)灰度隨提取物濃度的升高而顯著升高（p＜0.05），這與Cu2+/H2O2誘導(dǎo)蛋白氧化損傷的結(jié)果相一致。以上結(jié)果表明，迷迭香提取物能夠有效抑制AAPH誘導(dǎo)的BSA氧化降解。

2.3 迷迭香提取物對(duì)自由基誘導(dǎo)蛋白羰基化的影響

迷迭香提取物對(duì)自由基誘導(dǎo)BSA羰基化的影響見圖3。

圖3 迷迭香提取物對(duì)自由基誘導(dǎo)BSA羰基化的影響Fig.3 Effect of rosemary extract on carbonylation of BSA induced by free radicals

蛋白羰基化是衡量蛋白質(zhì)氧化損傷的一個(gè)重要指標(biāo)[16]。從圖3A可知，對(duì)照組BSA中羰基含量很低，為3.80 nmol/mg；經(jīng)Cu2+/H2O2處理90 min后，BSA羰基含量顯著升高至30.09 nmol/mg（p<0.05）。迷迭香提取物能有效抑制Cu2+/H2O2誘導(dǎo)BSA中羰基含量的升高（p<0.05），其抑制作用隨提取物添加濃度的升高而增強(qiáng)。由圖3B可知，AAPH處理組BSA羰基含量較對(duì)照組顯著升高（p<0.05）；迷迭香提取物能有效抑制AAPH誘導(dǎo)BSA中羰基含量的升高（p<0.05），其抑制作用隨添加濃度的升高而增強(qiáng)，與Cu2+/H2O2誘導(dǎo)下的結(jié)果相類似。

迷迭香提取物中含有的迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸和鼠尾草酚等多種多酚類物質(zhì)[10，17]，能夠通過清除Cu2+/H2O2及AAPH反應(yīng)體系產(chǎn)生的羥自由基、烷氧自由基等抑制BSA羰基化修飾。

2.4 迷迭香提取物對(duì)FeSO4誘導(dǎo)亞油酸氧化的抑制作用

迷迭香提取物對(duì)FeSO4誘導(dǎo)亞油酸氧化的影響見圖4。

圖4 迷迭香提取物對(duì)FeSO4誘導(dǎo)亞油酸氧化的影響Fig.4 Effect of rosemary extract on LA oxidation induced by FeSO4

LA是一種常見的多不飽和脂肪酸且極易發(fā)生脂質(zhì)氧化[18]。如圖4A所示，F(xiàn)eSO4處理組中LA共軛二烯含量為 152.20 μmol/L，顯著高于對(duì)照組（p<0.05）；迷迭香提取物能夠有效抑制FeSO4誘導(dǎo)LA共軛二烯含量的升高（p<0.05），其抑制作用隨添加濃度的升高而增強(qiáng)。

MDA是油脂中不飽和脂肪酸氧化分解所產(chǎn)生的次級(jí)氧化產(chǎn)物[19]。由圖4B可知，對(duì)照組LA氧化所產(chǎn)生的MDA含量很低，而在模型組中，F(xiàn)eSO4單獨(dú)處理后，LA發(fā)生脂質(zhì)氧化，導(dǎo)致其產(chǎn)生的MDA含量顯著升高（p＜0.05）；隨著處理組中迷迭香提取物濃度的升高，LA氧化所產(chǎn)生的MDA含量逐漸降低。這說明迷迭香提取物能夠有效抑制LA氧化，且抑制作用隨其濃度的升高而增強(qiáng)。這與姚雯等[20]研究血根堿對(duì)FeSO4誘導(dǎo)LA氧化影響的結(jié)果相一致。

2.5 迷迭香提取物對(duì)AMVN誘導(dǎo)亞油酸氧化的抑制作用

迷迭香提取物對(duì)AMVN誘導(dǎo)亞油酸氧化影響見圖5。

圖5 迷迭香提取物對(duì)AMVN誘導(dǎo)亞油酸氧化影響Fig.5 Effect of rosemary extract on LA oxidation induced by AMVN

AMVN在熱分解條件下會(huì)產(chǎn)生烷氧自由基，從而引發(fā)LA脂肪氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，加速油脂氧化。由圖5A可知，處理組中較低濃度的迷迭香提取物未能顯著抑制共軛二烯產(chǎn)物的生成，而其濃度為100 μg/mL～500 μg/mL 時(shí)，LA 脂質(zhì)氧化顯著得到抑制（p＜0.05）；由圖5B可知，在AMVN作用下，模型組LA發(fā)生脂質(zhì)氧化，而對(duì)照組LA氧化程度較低；從處理組中可以得出，迷迭香提取物可以顯著（p＜0.05）抑制MDA的生成，且其抑制效果隨提取物濃度（25 μg/mL～500 μg/mL）的升高而逐漸增強(qiáng)。

2.6 迷迭香提取物對(duì)AAPH誘導(dǎo)DNA氧化損傷的影響

迷迭香提取物對(duì)AAPH誘導(dǎo)DNA氧化損傷的抑制作用見圖6。

圖6 迷迭香提取物對(duì)AAPH誘導(dǎo)DNA氧化損傷的抑制作用Fig.6 Inhibitory effects of rosemary extract on AAPH-initiated DNA oxidative damage

DNA是機(jī)體遺傳信息的載體，AAPH產(chǎn)生的自由基會(huì)攻擊DNA，引發(fā)DNA氧化損傷，通過測定DNA氧化產(chǎn)物在532 nm處的吸光度可判斷其氧化損傷的程度。由圖6可知，迷迭香提取物能夠有效抑制AAPH誘導(dǎo)hsDNA氧化，其抑制率隨添加濃度的升高而顯著升高（p＜0.05）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)表明迷迭香提取物對(duì)不同自由基引發(fā)的蛋白質(zhì)氧化降解、羰基化修飾，脂質(zhì)氧化和DNA氧化損傷均有顯著的抑制作用，且抑制作用隨其濃度的升高而增強(qiáng)；出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是迷迭香提取物阻斷了Cu2+/H2O2、AAPH、FeSO4和AMVN等誘導(dǎo)劑引發(fā)的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從而抑制生物大分子及LA的氧化損傷。該研究為迷迭香提取物預(yù)防某些與蛋白氧化損傷有關(guān)的疾病及功能性食品的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。在今后的試驗(yàn)中應(yīng)采用動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)迷迭香提取物對(duì)自由基誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、油脂及DNA氧化的抑制作用及機(jī)制。