張秋紅，賈慶文

（1. 濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 濟(jì)南 250102；2. 山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，山東 濟(jì)南250101）

芪精鎮(zhèn)痛顆粒，是依據(jù)山東已故中醫(yī)藥名家周鳳梧教授擬定的芪精鎮(zhèn)痛湯[1]治療氣血虧虛型頭痛的經(jīng)驗(yàn)組方研制而成的制劑，目前為濟(jì)南某醫(yī)療機(jī)構(gòu)自制制劑，由炙黃芪、當(dāng)歸、茯苓、炙甘草、大棗、川芎、升麻等十味中藥組成。經(jīng)多年臨床使用證明，該制劑在補(bǔ)氣養(yǎng)血、疏風(fēng)散痛等方面有較好療效，臨床上主要用于氣血虧虛型頭痛。原制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單，僅有當(dāng)歸、川芎的薄層色譜（TLC）鑒別和常規(guī)制劑通則項(xiàng)下的檢查項(xiàng)目，缺少君藥與其他藥味的鑒別和含量測(cè)定，無(wú)法較全面控制制劑質(zhì)量。為保證芪精鎮(zhèn)痛顆粒質(zhì)量滿足療效，同時(shí)符合山東省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高的要求，本實(shí)驗(yàn)從定性定量?jī)蓚€(gè)方面對(duì)該制劑進(jìn)行全面研究，以期達(dá)到控制其質(zhì)量的目的。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀，SPD-20A檢測(cè)器（日本島津）； AE-100型電子天平（Mettler）；AE-240電子天平（Mettler）；WINCATS薄層照相系統(tǒng)（CAMAG）；硅膠G薄層板（Merck）；定量毛細(xì)管（美國(guó)Drummond公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（上?？坪悖?。

1.2 試藥

黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-201717），黃芪對(duì)照藥材（批號(hào)：121462- 201705），升麻對(duì)照藥材（批號(hào)：121182-201102），甘草對(duì)照藥材（批號(hào)：120904- 201620），阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：110773-201915），異阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：111698-201904）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。芪精鎮(zhèn)痛顆粒（濟(jì)南某醫(yī)療機(jī)構(gòu)自制制劑，批號(hào)：20190108，20190110，20190201，20190210，20190301，20190310，20190401，20190410，20190501，20190510）。甲醇、乙腈為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別[2]

2.1.1 炙黃芪[3]取本品顆粒3 g，加水5 ml使浸潤(rùn)，加入用水飽和的正丁醇30 ml，搖勻，超聲10 min，濾過(guò)，濾液用氨試液洗滌2次，每次25 ml，取正丁醇液，蒸干，加甲醇1 ml溶解殘?jiān)?，作為樣品溶液。另取黃芪對(duì)照藥材1 g，同法制成黃芪對(duì)照藥材溶液。再取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的黃芪甲苷對(duì)照品液。取去除炙黃芪制得的芪精鎮(zhèn)痛顆粒，按同法制成缺黃芪的陰性樣品溶液。吸取上述黃芪甲苷對(duì)照品液2 μl，其余3種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2）下層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴硫酸乙醇溶液（1→10），105 ℃加熱顯色。供試品色譜中，與對(duì)照品、對(duì)照藥材相應(yīng)位置上，顯棕色至棕褐色斑點(diǎn)；紫外光（365 nm）下顯橙黃色斑點(diǎn)。缺炙黃芪的陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見圖1～2。

圖1 炙黃芪的TLC圖（日光下）

圖2 炙黃芪的TLC 圖（365 nm）

2.1.2 升麻[3-4]取本品顆粒3 g，加乙醇30 ml，水浴回流1 h，濾過(guò)，蒸干濾液，加乙醇1 ml溶解殘?jiān)?，作為樣品溶液。另取升麻?duì)照藥材1 g，同法制成升麻對(duì)照藥材溶液。再取異阿魏酸對(duì)照品，制成每1 ml含1 mg的乙醇溶液，作為異阿魏酸對(duì)照品液。取去除升麻制得的芪精鎮(zhèn)痛顆粒，按同法制成缺升麻的陰性樣品溶液。吸取上述樣品溶液15 μl、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品液各2 μl、缺升麻的陰性樣品溶液10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-冰醋酸（12:2:1）為展開劑，展開，取出，晾干，紫外光（365，254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。缺升麻的陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見圖3～4。

圖3 升麻的TLC 圖（365 nm）

圖4 升麻的TLC圖（254 nm）

2.1.3 炙甘草[3]取本品顆粒3 g，加乙醚40 ml，回流1 h，濾過(guò)，棄去乙醚液，殘?jiān)蛹状?0 ml，回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，再用水飽和的正丁醇20 ml萃取3次，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌3次，取正丁醇液蒸干，加甲醇5 ml溶解殘?jiān)鳛闃悠啡芤?。另取甘草?duì)照藥材1 g，同法制成甘草對(duì)照藥材溶液。取去除炙甘草制得的芪精鎮(zhèn)痛顆粒，按同法制成缺炙甘草的陰性樣品溶液。吸取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一用1 % NaOH制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15:1:1:2）為展開劑，展開，取出，晾干。噴硫酸乙醇（1→10）液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的3個(gè)黃色斑點(diǎn)；紫外光（365 nm）下檢視，顯相同的6個(gè)熒光斑點(diǎn)。缺炙甘草的陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見圖5～6。

圖5 炙甘草的TLC 圖（日光）

圖6 炙甘草的TLC圖（365 nm）

2.2 HPLC含量測(cè)定[2]

2.2.1 色譜條件 島津 Wondasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1 %磷酸溶液（1:9）；檢測(cè)波長(zhǎng)321 nm；流速1.0 ml/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl。理論板數(shù)按阿魏酸計(jì)應(yīng)不低于4800。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取阿魏酸對(duì)照品、異阿魏酸對(duì)照品適量，加70 %甲醇制成每1 ml含阿魏酸、異阿魏酸各20 μg的混合溶液，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取芪精鎮(zhèn)痛顆粒細(xì)粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70 %甲醇25 ml，密塞，稱定重量，回流30 min，放冷，用70 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3 陰性樣品溶液的制備 處方中去除當(dāng)歸、川芎、升麻、酸棗仁后制成芪精鎮(zhèn)痛顆粒含量測(cè)定用陰性樣品, 并按2.2.2.2項(xiàng)制備方法制成含量測(cè)定用陰性樣品溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 分別吸取上述3種溶液各10 μl，注入液相色譜儀，混合對(duì)照品、供試品及陰性樣品色譜見圖色譜圖見圖7～9。表明該方法專屬性良好。

圖7 對(duì)照品溶液的HPLC圖

圖8 芪精鎮(zhèn)痛顆粒樣品溶液的HPLC圖

圖9 芪精鎮(zhèn)痛顆粒含量測(cè)定陰性樣品溶液的HPLC圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取阿魏酸、異阿魏酸混合對(duì)照品溶液（阿魏酸20.2 μg/ml，異阿魏酸20.4 μg/ml）2，5，10，20，40 μl，按2.1.1項(xiàng)下方法分別注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。分別以阿魏酸進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)；以異阿魏酸進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪得標(biāo)準(zhǔn)曲線。阿魏酸的回歸曲線方程為Y=5.31×103X+7.90×102，r=1.0000；異阿魏酸的回歸曲線方程為Y=4.84×103X+1.71×103，r=1.0000。結(jié)果表明，阿魏酸在40.4～808 ng（r= 1.0000）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，異阿魏酸在40.8～816 ng（r=1.0000）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取批號(hào)為20190510的供試品溶液10 μl，室溫下分別于0，2，6，12，18，24 h，注入色譜儀，測(cè)定阿魏酸、異阿魏酸峰面積，計(jì)算RSD，分別為1.09 %（n=6），1.67 %（n=6）。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，不影響阿魏酸與異阿魏酸成分的測(cè)定。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μl，注入色譜儀，測(cè)定阿魏酸異阿魏酸峰面積，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算RSD，分別為0.17 %（n=6），1.28 %（n=6）。表明儀器的精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一樣品（批號(hào)20190201）6份，每份約1 g，精密稱定，按2.2.2.2項(xiàng)方法制成供試品溶液，每份精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定阿魏酸、異阿魏酸的含量，計(jì)算RSD，結(jié)果分別為1.00 %（n=6），1.85 %（n=6）。表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 取含阿魏酸0.4683 mg/ml，含異阿魏酸0.2504 mg/ml的芪精鎮(zhèn)痛顆粒（批號(hào)20190201）12份，研細(xì)，6份精密稱取約0.5 g加入阿魏酸對(duì)照品溶液（20.2 μg/ml）10 ml，6份加入異阿魏酸對(duì)照品溶液（20.76 μg/ml）10 ml。按2.2.2.2項(xiàng)方法制成不同的12份供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)色譜條件，注入液相色譜儀，測(cè)定阿魏酸、異阿魏酸峰面積，計(jì)算回收率。兩個(gè)成分的RSD均未超過(guò)2.0 %，表明該方法準(zhǔn)確性良好。見表1。

2.2.9 樣品含量測(cè)定 稱取樣品粉末各約1 g，精密稱定，制成供試品溶液，分別精密吸取10 μl，注入色譜儀，測(cè)定阿魏酸、異阿魏酸含量，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表2 芪精鎮(zhèn)痛顆粒中阿魏酸、異阿魏酸含量

10批樣品含量測(cè)定結(jié)果均大于0.75 mg/g，根據(jù)測(cè)定結(jié)果規(guī)定本品每1 g含阿魏酸（C21H20O9）與異阿魏酸（C21H20O9）的總量不得少于0.45 mg。

3 討論

3.1 TLC鑒別的討論

3.1.1 炙黃芪 3種提取方法均可用于炙黃芪定性，但用超聲法提取的供試品溶液雜質(zhì)多，底色較深，且原點(diǎn)附近有黑色斑點(diǎn)拖尾嚴(yán)重；用中性氧化鋁柱提取的供試液，能有效除去糖類及脂溶性的干擾。但由于方中所含藥物較多，成分復(fù)雜，故無(wú)效斑點(diǎn)亦較多。而用堿性溶劑（氨水）提取的供試品溶液能有效去除阿魏酸[5]、異阿魏酸、甘草酸等酸性成分，氨水洗滌的另一重要作用是將其他黃芪皂苷類成分轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷，提高黃芪甲苷的含量，有利于測(cè)定。結(jié)果表明，色譜分離效果更好，色譜斑點(diǎn)清晰，無(wú)干擾，黃芪甲苷斑點(diǎn)的Rf值約為0.42～0.52。綜合考慮，用氨水洗滌法是最簡(jiǎn)便可行的提取方法。但預(yù)飽和后仍有較為明顯的邊緣效應(yīng)，需進(jìn)一步查找原因找出可行方法減少邊緣效應(yīng)影響。

3.1.2 升麻 在此實(shí)驗(yàn)中，以苯-三氯甲烷-冰醋酸（12:2:1）為展開劑進(jìn)行展開，但在薄層板上出現(xiàn)展開劑前沿分層，考慮到所購(gòu)的預(yù)制板結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，會(huì)影響展開效果；且展開劑本身極性不同，存在分層。綜合考慮，將預(yù)制板先放入展開劑中空跑一遍，晾干，再作為展開板使用，效果可靠、明顯。結(jié)果表明，經(jīng)篩選優(yōu)化后的條件，用于升麻的TLC鑒別，其分離效果好，斑點(diǎn)邊緣清晰、圓整，不擴(kuò)散，無(wú)拖尾，無(wú)邊緣效應(yīng)，可用于芪精陣痛顆粒中升麻的TLC定性鑒別分析。

3.1.3 炙甘草 炙甘草的TLC圖譜顯示，處方中其他成分及輔料均無(wú)干擾。該方法專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，靈敏度高，且陰性無(wú)干擾，可用于芪精鎮(zhèn)痛顆粒的質(zhì)量控制。

3.2 HPLC含量測(cè)定的討論

3.2.1 含量測(cè)定中供試品溶液的制備 分別采用70 %甲醇溶液、70 %乙醇溶液、50 %乙醇溶液、10 %乙醇溶液，10 %乙醇和70 %甲醇制備供試品溶液，測(cè)得含量相差不大，但過(guò)濾困難。以50 %乙醇、70 %乙醇溶液和70 %甲醇溶液為溶劑制備供試品溶液，測(cè)得含量差異較大，且50 %乙醇溶液過(guò)濾困難。綜合考慮，最終選用70 %甲醇作為供試品溶劑。

3.2.2 陰性對(duì)照品制備 參照文獻(xiàn)[5-8]，當(dāng)歸、川芎、升麻、酸棗仁含所測(cè)成分，故選用剩余五味中藥按處方工藝制備陰性對(duì)照品。

3.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 根據(jù)阿魏、異阿魏酸在70 %甲醇溶液中的紫外吸相關(guān)文獻(xiàn)[4,9-17]，選擇321 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2.4 流動(dòng)相的選擇 首先選用甲醇-1 %醋酸溶液（30:70），但阿魏酸、異阿魏酸達(dá)不到分離效果。后改變甲醇-1 %醋酸溶液比例（13:87），異阿魏酸分離效果不好，后選用乙腈-0.1 %磷酸溶液（13:87）作為流動(dòng)相，異阿魏酸分離效果不好，后選用乙腈-0.1 %磷酸溶液（13:87），結(jié)果表明，阿魏酸、異阿魏酸分離效果良好，故選用乙腈-0.1 %磷酸溶液（13:87）為流動(dòng)相。

3.2.5 含量測(cè)定結(jié)果分析 本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC同時(shí)測(cè)定2種成分阿魏酸、異阿魏酸的含量，該方法精密度良好，靈敏度高，專屬性好，可用于芪精鎮(zhèn)痛顆粒中阿魏酸、異阿魏酸的含量測(cè)定。

綜上，建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法簡(jiǎn)便可行，使芪精鎮(zhèn)痛顆粒的質(zhì)量得到有效控制。