盧湧湧 陶利萍 武志剛 張棋 蔣斌浩

[摘要] 目的 研究葡萄球菌核酸酶樣結(jié)構(gòu)蛋白1（SND1）在膀胱癌組織內(nèi)的基因及蛋白表達(dá)，并探討其臨床意義。方法 對GEO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行深入挖掘，觀察SND1基因在膀胱癌中的表達(dá)，并分析其與患者臨床信息及預(yù)后的關(guān)系;收集115例膀胱癌患者的臨床預(yù)后資料，免疫組化法檢測癌組織內(nèi)SND1蛋白的表達(dá)，分析患者的臨床預(yù)后與SND1蛋白之間的關(guān)系。 結(jié)果 115例GSE31684數(shù)據(jù)集中膀胱癌組織中SND1表達(dá)升高，且與患者的腫瘤大小、腫瘤分期、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，SND1高表達(dá)患者的總生存率及無復(fù)發(fā)生存率均低于SND1低表達(dá)患者。結(jié)論 在膀胱癌組織中SND1表達(dá)升高與患者預(yù)后不良相關(guān)，SND1可能是預(yù)測膀胱癌進(jìn)程與預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞] SND1;膀胱癌;預(yù)后;總生存率;無復(fù)發(fā)生存率

[中圖分類號] R737.14 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）18-0005-04

Expression and clinical significance of SND1 in bladder cancer

LU Yongyong1 ? TAO Liping2 ? WU Zhigang1 ? ZHANG Qi1 ? JIANG Binhao1

1.Department of Urology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou ? 325000，China;2.Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou ? 325000，China

[Abstract] Objective To study the gene and protein expression of staphylococcal nuclease domain-containing protein 1（SND1） in bladder cancer and to explore its clinical significance. Methods The GEO database was deeply mined. The expression of SND1 gene in bladder cancer was observed. Its relationship with clinical information and prognosis of patients was analyzed. The clinical prognostic data of 115 patients with bladder cancer were collected. SND1 in cancer tissues was detected by immunohistochemistry. The relationship between clinical prognosis and SND1 protein was analyzed. Results The expression of SND1 in bladder cancer tissue of 115 cases of GSE31684 data set was increased， and it was related to the tumor size， tumor stage， histological type， and lymph node metastasis. The overall survival rate and relapse-free survival rate of patients with high SND1 expression were lower than those with low expression of SND1. Conclusion The increased expression of SND1 in bladder cancer tissue is related to the poor prognosis of patients. SND1 may be a potential molecular marker to predict the progression and prognosis of bladder cancer.

[Key words] SND1;Bladder cancer;Prognosis;Overall survival rate;Relapse-free survival rate

膀胱尿路上皮癌（膀胱癌）是泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一[1]，據(jù)估計(jì)2012年全世界新增42.98萬例膀胱癌患者，死亡165 100例[2]，在我國膀胱癌發(fā)病率呈上升趨勢。盡管約75%的患者在最初診斷時(shí)為非肌浸潤性膀胱癌，但在接受各種手術(shù)與輔助治療后，有10%～30%的患者不僅復(fù)發(fā)而且發(fā)展為肌浸潤性膀胱癌，在進(jìn)一步接受復(fù)雜的根治性膀胱切除術(shù)和盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)后，約30%最終會(huì)發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病，這是造成多數(shù)膀胱癌患者腫瘤特異性死亡的主要原因[3-6]。因此，臨床上迫切需要一種能夠準(zhǔn)確預(yù)測膀胱癌進(jìn)程與預(yù)后的分子標(biāo)志物，可以早期識(shí)別可能發(fā)展為肌浸潤性膀胱癌的患者，實(shí)現(xiàn)早期診斷，改善預(yù)后[7]。

葡萄球菌核酸酶樣結(jié)構(gòu)蛋白1（SND1），也稱為“Tudor葡萄球菌核酸酶”或“P100”，是一種多功能蛋白質(zhì)，在人類及其他物種中存在廣泛表達(dá)，具有保守性。SND1參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、mRNA剪接、RNA編輯和miRNA介導(dǎo)的mRNA降解等功能，是RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）中的核酸酶，SND1可以作為轉(zhuǎn)錄共刺激因子促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的結(jié)合[8-12]。有研究表明其在肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多個(gè)癌種中存在過表達(dá)現(xiàn)象，且與肺癌、肝癌和前列腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13-18]。然而目前尚無SND1與膀胱癌的相關(guān)研究，因此本研究對GEO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，評估SND1基因在膀胱癌中的表達(dá)，并結(jié)合我院現(xiàn)有的臨床隨訪及標(biāo)本數(shù)據(jù)庫，對膀胱癌組織中SND1蛋白的表達(dá)進(jìn)行免疫組化染色觀察，了解SND1蛋白表達(dá)與膀胱癌臨床病理因素及患者預(yù)后的關(guān)系。

1資料與方法

1.1 一般資料

通過對GEO數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索，下載膀胱癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE42089、GSE3167、GSE31684的基因表達(dá)矩陣進(jìn)行后續(xù)分析。GSE42089包含10例膀胱癌組織與8例正常膀胱組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，GSE3167包含41例膀胱癌組織與9例正常膀胱組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，而GSE31684不僅包含93例行膀胱全切術(shù)的膀胱癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并附帶了詳細(xì)的臨床信息（包括患者的年齡、性別、腫瘤分期、組織學(xué)類型、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及患者的生存信息等）。

收集我院2012年1月～2014年12月間確診膀胱癌患者的臨床病理及預(yù)后資料，共115例，年齡39～81歲，平均63.4歲，男85例，女30例，其中行膀胱全切術(shù)（RC）45例，行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（TURBT）70例。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理確診為膀胱尿路上皮癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他膀胱疾病史;②合并其他腫瘤病史;③合并其他可能影響研究結(jié)果的疾病史。

1.2方法

利用GSE42089、GSE27448數(shù)據(jù)集，比較SND1的基因表達(dá)水平在正常膀胱組織及膀胱癌組織中的差異情況。利用GSE31684數(shù)據(jù)集，比較SND1的基因表達(dá)水平與膀胱癌臨床病理因素的關(guān)系，并分析SND1基因表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系，其中SND1高、低表達(dá)組的分組依據(jù)為GSE31684數(shù)據(jù)集中的SND1表達(dá)值的中位數(shù)。

免疫組化研究分析115例膀胱癌患者癌組織標(biāo)本，并建立臨床病理及預(yù)后資料數(shù)據(jù)庫，病理分期基于2009 TNM分期系統(tǒng)[19]，腫瘤組織學(xué)分級基于2004年WHO分類系統(tǒng)[20]。SP法免疫組化染色按常規(guī)進(jìn)行，簡要流程如下：蠟塊切片（4 μm/片），常規(guī)脫蠟水化，胃蛋白酶消化，EDTA抗原液修復(fù)，一抗（1：200; ab65078，Abcam）孵育過夜（4℃），二抗（50 μL，帶生物素標(biāo)記）孵育20～30 min，加入卵白素室溫下孵育，確定顯色適時(shí)終止。IHS法半定量分析：①染色強(qiáng)度，以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)弱計(jì)分（記為a）：無明顯著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分;②陽性細(xì)胞率，即5個(gè)視野（每400×高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)此類細(xì)胞）的陽性細(xì)胞的平均數(shù)（記為b）：1%～10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分;③a×b乘積為IHS評分，IHS評分≤6分為低表達(dá)，>6分為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);生存分析統(tǒng)計(jì)及作圖采用Graphpad Prism6軟件和Log-rank檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SND1基因在膀胱癌組織中的表達(dá)情況

見圖1。在數(shù)據(jù)集GSE42089與GSE3167膀胱癌組織中的SND1基因高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0139、0.0025）。

2.2 SND1基因表達(dá)與膀胱癌患者臨床病理因素之間的關(guān)系

見表1。在GSE31684數(shù)據(jù)集中，SND1高、低表達(dá)組患者在性別、年齡方面無明顯差異（P=0.926、0.331）。SND1高表達(dá)組患者在腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面與SND1低表達(dá)組間有顯著性差異（P=0.012、0.022和0.008），在腫瘤組織學(xué)類型上，高級別膀胱癌患者中SND1高表達(dá)占比（45/87）高于低級別膀胱癌患者（1/6），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.215）。

2.3 SND1基因表達(dá)水平與膀胱癌患者臨床預(yù)后相關(guān)性

見圖2。GSE31684數(shù)據(jù)集中SND1高表達(dá)組患者的總生存率（OS）與無復(fù)發(fā)生存率（RFS）均顯著低于SND1低表達(dá)組（OS：HR=1.673， 95%CI：1.048～2.790，P=0.0347;RFS：HR=1.965，95%CI：1.039～3.652，P=0.0383）。

2.4 SND1蛋白表達(dá)水平與膀胱癌患者臨床病理因素之間的關(guān)系

對115例膀胱癌組織的免疫組化觀察發(fā)現(xiàn)，SND1蛋白主要定位于膀胱癌細(xì)胞胞漿內(nèi)（封三圖1），SND1蛋白高、低表達(dá)組患者在性別、年齡、腫瘤數(shù)目方面無明顯差異（P=0.926、0.963和0.078）。SND1高表達(dá)組患者在腫瘤大小、腫瘤分期、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面與SND1低表達(dá)組之間存在顯著差異（P=0.008、0.000、0.008和0.014），見表2。

2.5 SND1蛋白表達(dá)水平與膀胱癌患者臨床預(yù)后相關(guān)性

見圖3。45例膀胱全切患者中，SND1高表達(dá)組的OS顯著低于SND1低表達(dá)組（HR=2.552，95%CI：1.033～5.976，P=0.0270）;RFS亦顯著降低（HR=2.723， 95%CI：1.021～6.484，P=0.0461），70例TURBT患者中，SND1高表達(dá)組的RFS顯著低于SND1低表達(dá)組（HR=2.577，95%CI：1.160～5.011，P=0.0209），OS亦低于SND1低表達(dá)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=2.316，95%CI：0.9583～5.119，P=0.0667）。

3討論

本研究中對GEO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行深入挖掘，免疫組化法檢測115例膀胱癌組織中SND1蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于正常膀胱黏膜組織，膀胱癌組織中的SND1基因表達(dá)明顯升高，提示SND1高表達(dá)可能與膀胱癌的發(fā)生有關(guān)，與SND1在乳腺癌、肝癌中的高表達(dá)相似[13，14]。進(jìn)一步分析表明，肌浸潤性膀胱癌患者及淋巴浸潤患者不論SND1基因水平還是蛋白水平均高于非肌浸潤性膀胱癌患者和無淋巴浸潤患者。SND1蛋白水平在不同腫瘤組織學(xué)分級上存在顯著差異，但 SND1基因水平在此差異尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與GSE31684數(shù)據(jù)集中的研究人群絕大多數(shù)（87/93）為高級別腫瘤患者有關(guān)，存在一定的選擇偏倚。GSE31684的數(shù)據(jù)還表明SND1基因表達(dá)與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，而115例患者的數(shù)據(jù)則表明SND1蛋白表達(dá)與腫瘤大小相關(guān)。

SND1的表達(dá)在膀胱癌不同分期、分化、轉(zhuǎn)移方面的差異提示SND1可能與膀胱癌的預(yù)后相關(guān)，促使進(jìn)一步分析SND1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示在GSE31684中SND1高表達(dá)組患者的OS與RFS均顯著低于SND1低表達(dá)組，而115例患者中也存在類似的差異，雖然TURBT患者中SND1高、低表達(dá)組患者間的OS尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與TURBT患者病情隨訪時(shí)間相對不長有關(guān)（一般來說，TURBT患者腫瘤分期相對較低、分化較好，因此總生存率相對較長）。

目前雖然沒有SND1與膀胱癌的報(bào)道，但有多個(gè)研究報(bào)道SND1與其他癌種的關(guān)系。與正常肝組織相比，74%（81/109）的肝癌組織中SND1表達(dá)升高，SND1可能通過降解腫瘤抑制基因mRNAs及激活胰島素樣生長因子信號而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[21]。在結(jié)腸癌中SND1參與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，影響E-cadherin轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[16]。在不同的乳腺癌細(xì)胞系中，SND1的表達(dá)水平與細(xì)胞系的侵襲能力呈正相關(guān)[22];SND1可上調(diào)SMURF1（Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1），破壞細(xì)胞骨架F-肌動(dòng)蛋白在腫瘤細(xì)胞中的粘附能力，從而增加乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的可能性[23， 24]。在30例晚期乳腺癌的活檢中，有9例遠(yuǎn)處灶呈SND1高表達(dá)，而原發(fā)灶卻是SND1低表達(dá)，提示在乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中，SND1的表達(dá)被誘導(dǎo)和上調(diào)[13]。雖然在膀胱癌中，目前尚不清楚SND1的具體作用機(jī)制，但鑒于SND1存在物種間的廣泛表達(dá)與保守性，推測在膀胱癌中SND1可能存在類似的作用機(jī)制。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中SND1表達(dá)升高，且與腫瘤的分期、分化、轉(zhuǎn)移相關(guān)，與患者的不良預(yù)后相關(guān)，SND1可能是預(yù)測膀胱癌進(jìn)程與預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物，但需要更多中心更多臨床病例的證實(shí)，其具體作用機(jī)制也需要進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2019-12-03）