溫 凱，胡 驥，鄧雪松，趙海龍，羅田偉，陳孟毅，許 林，秦翔宇，于菁菁，崔海平,*

1.中國原子能科學(xué)研究院，北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413

前列腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，是男性癌癥中發(fā)病率第二、死亡率第五的癌癥[1-3]。近年來國內(nèi)前列腺癌發(fā)病率也呈顯著升高趨勢，2015年，前列腺癌新增患者6.03萬人，因前列腺癌死亡2.66萬人[4]。前列腺特異性抗原(PSA)篩查可以為大部分患者提供早期診斷，但對于會出現(xiàn)高風(fēng)險或轉(zhuǎn)移灶的部分患者，導(dǎo)致無法給出準(zhǔn)確的診斷[5-6]。早期準(zhǔn)確的診斷和分期對于選擇有效的治療至關(guān)重要。傳統(tǒng)的成像方式如計算機斷層掃描(CT)和核磁共振(MRI)存在一定的缺陷[7]，特別是在低前列腺特異抗原(PSA)水平下，漏診和誤診率較高。使用正電子發(fā)射斷層掃描(PET)對于診斷前列腺癌有非常好的前景，使用傳統(tǒng)診斷試劑，如膽堿(11C/18F-Choline)或氟脫氧葡萄糖(18F-FDG)進行正電子發(fā)射斷層掃描對于中晚期前列腺癌的診斷有很好的效果，但對于早期前列腺癌及其轉(zhuǎn)移性病灶的診斷仍存在一定的局限性。

前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)是Ⅱ型跨膜糖蛋白，最早在人類前列腺癌細胞系LNCaP中發(fā)現(xiàn)[8]。PSMA在前列腺癌細胞中顯著升高，可以作為診斷和治療的理想靶點。谷氨酸-脲-賴氨酸(Glu-Urea-Lys)是靶向PSMA的小分子抑制劑，尤其是含谷氨酸-脲-賴氨酸序列的小分子抑制劑，能高效、特異性地與PSMA結(jié)合。Glu-Urea-Lys有生物學(xué)活性穩(wěn)定、體內(nèi)循環(huán)半衰期短、組織滲透性好的特點，在前列腺癌分子影像學(xué)診斷方面具有更好的應(yīng)用價值[9-10]。使用正電子核素68Ga標(biāo)記PSMA小分子抑制劑可以與前列腺癌細胞特異性結(jié)合，通過PET-CT顯像對前列腺癌及其轉(zhuǎn)移灶的診斷有重要意義，68Ga-PSMA已成為國際研究的熱點[11-15]。

為了開發(fā)一種新型的具有較好體內(nèi)、體外性質(zhì)的68Ga標(biāo)記的PSMA小分子化合物，并適當(dāng)提升標(biāo)記物的親脂性、延長腫瘤攝取時間[16]， 選擇1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)作為螯合劑。DOTA是68Ga標(biāo)記物應(yīng)用最廣泛的螯合劑，具有易于標(biāo)記、穩(wěn)定性好的特點。在已有的研究[17]基礎(chǔ)上，保持化合物核心結(jié)構(gòu)不變，設(shè)計了以谷氨酸-脲-賴氨酸(Glu-Urea-Lys)為核心基團，以1-萘基丙氨酸、4-胺甲基環(huán)己甲酸、苯丙氨酸(Ala(Nap)-Cyh-Phe，以下簡稱ANCP)為側(cè)鏈，以DOTA為螯合基團的新型PSMA小分子抑制劑DOTA-ANCP-PSMA，如圖1所示。首先合成前體化合物，使用直接標(biāo)記法進行68Ga標(biāo)記；對標(biāo)記物的體內(nèi)外性質(zhì)開展評價，分別測定體外穩(wěn)定性、脂水分配系數(shù)，開展正常小鼠和荷LNCaP腫瘤裸鼠的生物分布的實驗，最后通過PET-CT顯像測定其顯像效果。

1 實驗方法

1.1 材料和儀器

68Ge-68Ga發(fā)生器(740 MBq)，德國ITM公司；鹽酸、醋酸、醋酸鈉，加拿大Alfa Aesar公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，純度98%，美國Sigma Aldrich公司；無水乙醇，分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司；乙醇，分析純，純度95%，國藥化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純，德國Merck；超純水，德國Millipore純水儀制造；Sep-Pak C-18柱，美國Waters公司；異氟烷，純度99.998%，深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

圖1 PSMA-ANCP-DOTA的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of PSMA-ANCP-DOTA

CRC-55TW活度計，美國Capintec公司；2470全自動伽馬計數(shù)器，美國Perkin Elmer公司；VORTEX3螺旋振蕩器，德國IKA公司；JHX-100恒溫加熱器，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；雷磁PHS-3E pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ML303電子天平，精度0.001 g，德國Mettler Toledo公司；LC-20AT高效液相色譜、BPD-20A HPLC紫外檢測器、CTO-10AS HPLC柱溫箱，日本島津公司；Bioscan色譜儀伽馬計數(shù)器，德國Eckert&Ziegler公司；Iertsil ODS-SP C18 RP-HPLC色譜柱，φ4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm，日本島津公司；Avance 400M核磁共振儀，瑞士Bruker公司；3200Q TRAP質(zhì)譜儀，美國ABSCIEX公司；Iris PET-CT，法國Inviscan公司；動物麻醉機，法國Minerve公司。

昆明小鼠，6～8周，23～25 g。裸鼠，SPF級、4～6周齡、體重(22±2) g，雄性。

腫瘤接種方法：將對數(shù)生長期的源前列腺癌細胞系用胰酶消化、離心、清洗3遍后，收集細胞，使用1640培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸濁液濃度調(diào)整為每毫升5×106個細胞。接種腫瘤細胞于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，每只接種5×106個細胞。正常條件飼養(yǎng)，待腫瘤直徑達1 cm以上時處死，在無菌條件下剝離腫瘤，用生理鹽水清洗數(shù)次，剔除壞死的組織，選擇生長良好的腫瘤組織，切割成3.4 mm大小的腫瘤塊，以特制的組織接種器將腫瘤組織移植到右側(cè)腋窩皮下。腫瘤生長至直徑0.8～1.0 cm時用于實驗。

1.2 前體化合物的合成

前體化合物的合成按照已有的合成工藝路線[17]開展，合成標(biāo)記流程示于圖2。以 Fmoc-Lys(Dde)-Wang Resin(化合物1)為起始原料，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)浸泡，加入3倍體積的哌啶(Pip)質(zhì)量分數(shù)為20%的DMF溶液，用以脫除Fmoc。抽干20%Pip/DMF，DMF洗滌5次。投入N,N′-琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)、N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，反應(yīng)1 h。將H-Glu(OtBu)-OtBu·HCl加入至反應(yīng)器中，加入適量DMF，反應(yīng)1 h。用切割液E液(純TFA、茴香硫醚、水、苯酚、1,2-乙二硫醇)切割反應(yīng)1 h，使用茚三酮檢測是否完全連接。加入3倍體積的DMF溶液(w(水合肼)=2%)，反應(yīng)30 min，脫去1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代環(huán)己亞基)乙基(Dde)保護基團，DMF洗滌5次，獲得化合物2。

圖2 68Ga-DOTA-ANCP-PSMA的合成路線Fig.2 Synthesis of 68Ga-DOTA-ANCP-PSMA

依次連接1-萘基丙氨酸、4-胺甲基環(huán)己甲酸、苯丙氨酸，加入氨基酸(n(氨基酸)∶n(化合物2)=3∶1)。加入側(cè)鏈所需的氨基酸、化合物2、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基異脲六氟磷酸鹽(HBTU)、N-甲基嗎啡啉(NMM)。將合成產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至切割管中，加入E液，振蕩切割反應(yīng)1 h，得到化合物3。加入螯合劑DOTA(n(DOTA)∶n(化合物3)=3∶1)，加入適量DMF，反應(yīng)1 h；將合成產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至切割管中，加入E液振蕩切割反應(yīng)1 h。將切割液收集至離心管中，加入6倍體積的冰乙醚，低速離心機沉淀。將沉淀的粗品用乙醚洗三遍，通過半制備色譜柱純化得到化合物4，如圖2所示。

1.3 68Ga的放射性標(biāo)記

取冷凍的DOTA-ANCP-PSMA制劑，用超純水配制成5 g/L溶液。取4 μL溶液置于EP反應(yīng)管中，向DOTA-ANCP-PSMA中加入65 μL 1.0 mol/L醋酸鈉溶液。取3.5 mL 0.05 mol/L HCl溶液，淋洗68Ge-68Ga發(fā)生器；取1.0 mL淋洗68Ga的 0.05 mol/L HCl溶液(約37～185 MBq)，加入反應(yīng)管，并置于95 ℃的恒溫加熱器中，200 r/min下反應(yīng)15 min。將反應(yīng)溶液用2 mL注射器取出并用活度計測量總活度，注入到活化的Sep-Pak C18柱(預(yù)處理后)中，以3.0 mL純水沖洗雜質(zhì)；在C18柱上安裝0.22 μm微孔濾膜，以1.0 mL 95%乙醇溶液淋洗，收集到無菌真空瓶中。

1.4 體外穩(wěn)定性研究

68Ga-DOTA-ANCP-PSMA的放射化學(xué)穩(wěn)定性研究在磷酸緩沖液(PBS)和小牛血清(BSA)兩種體系中開展。

PBS法：置于0.5 mL的磷酸緩沖液(pH=7.4)中，37 ℃下孵育30、60、90、120、150 min后，采用HPLC測定其放射化學(xué)純度，以測定其體外穩(wěn)定性。

血清法：置于0.5 mL的小牛血清溶液(pH=7.0)中，37 ℃下孵育30、60、90、120、150 min時，采用HPLC測定其放射化學(xué)純度，以測定其體外穩(wěn)定性。

1.5 脂水分配系數(shù)的測定

標(biāo)記物通過Sep-Pak C18柱分離純化得到，使用95%乙醇洗脫。將獲得的標(biāo)記物通過干燥的氮氣吹干，使用相同體積的(0.5 mL∶0.5 mL)正辛醇和磷酸緩沖溶液(pH=7.4)將得到的標(biāo)記物溶于1.5 mL EP管(約3.7 MBq)中。充分振蕩5 min，在離心機中離心5 min，轉(zhuǎn)速為2 000 r/min，靜置分層。分別取有機相和水相各100 μL于EP管中，在井型γ探測器中分別測量其放射性計數(shù)，由有機相和水相的放射性計數(shù)率的比值來計算脂水分配系數(shù)P：

P=lg(No/Nw)

式中，No和Nw分別為有機相和水相樣品的放射性計數(shù)率，s-1。重復(fù)操作3次，取平均值為該標(biāo)記物的脂水分配系數(shù)。

1.6 正常鼠的生物分布

取正常鼠16只，4只一組，取0.15 mL(1.11～1.85 MBq)的68Ga-DOTA-ANCP-PSMA通過尾靜脈注射。在15、30、60、90 min時取血，斷頸處死，處死后分別取心臟、肺、肝、脾、腎、胰腺、胃、小腸、大腸、膀胱、骨、肌肉等器官。將各器官進行稱重，測放射性計數(shù)，計數(shù)通過標(biāo)準(zhǔn)液進行標(biāo)準(zhǔn)校正，經(jīng)過計算得到每克組織的放射性攝取。

1.7 荷瘤裸鼠的生物分布

取荷瘤裸鼠12只，3只一組，取0.15 mL(1.11～1.85 MBq)的68Ga-DOTA-ANCP-PSMA通過尾靜脈注射。在5、15、30、60 min時斷頸處死，處死后分別取心臟、肺、肝、脾、腎、胰腺、胃、小腸、大腸、膀胱、骨、肌肉、腫瘤等器官，并進行取血。將各器官進行稱重，測放射性計數(shù)，計數(shù)通過標(biāo)準(zhǔn)液進行標(biāo)準(zhǔn)校正，經(jīng)過計算得到每克組織的放射性攝取。

1.8 PET-CT顯像

小型PET顯像研究時，取0.15 mL(1.85～3.7 MBq)的68Ga-DOTA-ANCP-PSMA通過尾靜脈注射到荷瘤裸鼠中。異氟烷麻醉后的動物俯臥式固定在動物PET掃描儀上，從注射后15 min開始掃描15 min靜態(tài)PET-CT影像；之后從注射后60 min開始掃描15 min靜態(tài)PET-CT影像。

阻斷顯像實驗，首先按照2 mg/kg給小鼠注射2-(膦酰甲基)戊二酸(2-(phosphonomethyl)pentanedioic acid,2-PMPA)， 每只約50 μL。2-PMPA是高效選擇性的谷氨酸羧肽酶Ⅱ抑制劑，對PSMA具有較強的抑制作用。之后取0.15 mL(1.85～3.7 MBq)68Ga-DOTA-ANCP-PSMA，通過尾靜脈注射到荷瘤裸鼠中。異氟烷麻醉后的動物俯臥式固定在小型PET掃描儀上，從注射后15 min開始PET掃描15 min，CT掃描1 min；之后從注射后60 min開始掃描15 min，CT掃描1 min，獲得靜態(tài)PET-CT影像。

2 結(jié)果與討論

2.1 前體化合物的表征

化合物DOTA-ANCP-PSMA的質(zhì)譜圖示于圖3。由圖3可知：593.4處為(M-2H)/2峰，1 187.0處為M-H峰，其實際分子量為1 188.6，根據(jù)質(zhì)譜結(jié)構(gòu)確證其結(jié)構(gòu)正確。前體化合物DOTA-ANCP-PSMA的HPLC圖譜示于圖4。由圖4可知，DOTA-ANCP-PSMA的純度大于95%。色譜的流動相：0.1%(體積分數(shù)，下同)TFA的水和含0.1%TFA的乙腈溶液，0—13 min，20%—55%乙腈相；13—15 min，55%乙腈相；15—18 min，55%—20%乙腈相。

圖3 DOTA-ANCP-PSMA的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of DOTA-ANCP-PSMA

圖4 DOTA-ANCP-PSMA的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chomatography of DOTA-ANCP-PSMA

2.2 68Ga標(biāo)記結(jié)果

純化后68Ga-DOTA-ANCP-PSMA的HPLC圖譜示于圖5。由圖5可知，純化后的68Ga-DOTA-ANCP-PSMA在放射性檢測器上顯示的保留時間為12.104 min。由圖4可知，前體化合物的保留時間為11.748 min。由于色譜儀的紫外檢測器與放射性檢測器為串聯(lián)方式，同一化合物的保留時間相差0.3～0.4 min，即放射性標(biāo)記物的保留時間與前體化合物的保留時間一致。68Ga-DOTA-ANCP-PSMA的標(biāo)記率大于95%，純化后放射化學(xué)純度可達95.3%，其中保留時間約2.8 min處為游離的68Ga3+，峰面積比為1.4%，約11.8 min處的雜質(zhì)為前體化合物中的多肽雜質(zhì)與68Ga3+螯合形成的放射性雜質(zhì)，峰面積比為3.3%。純化后的產(chǎn)品收率為75%～81%(衰變校正后)。

圖5 純化后68Ga-DOTA-ANCP-PSMA的HPLC圖譜Fig.5 HPLC chomatography of 68Ga-DOTA-ANCP-PSMA

2.3 體外穩(wěn)定性研究

◆——PBS，■——BSA圖6 兩個體系下68Ga-DOTA-ANCP-PSMA的放射化學(xué)穩(wěn)定性Fig.6 Radiochemistry purity stability of 68Ga-DOTA-ANCP-PSMA in two systems

對PBS和BSA體系中68Ga-DOTA-ANCP-PSMA的放射化學(xué)純度進行了穩(wěn)定性測試，結(jié)果示于圖6。由圖6可知：PBS體系中，從30 min開始至150 min，68Ga-DOTA-ANCP-PSMA的放射化學(xué)純度略有降低，但穩(wěn)定性始終保持在95%以上，說明其在PBS中的穩(wěn)定性良好；對于BSA體系，從30 min開始，放射化學(xué)純度持續(xù)略微下降，至90 min，已略低于95%。這說明68Ga-DOTA-ANCP-PSMA在BSA中的穩(wěn)定性比PBS條件下略差，也預(yù)示在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性會有一定的降低，但在90 min維持在95%左右，可以滿足PET顯像的需求。

2.4 脂水分配系數(shù)結(jié)果

68Ga-DOTA-ANCP-PSMA的脂水分配系數(shù)為-1.42±0.02(n=3)。與結(jié)構(gòu)類似的標(biāo)記物68Ga-NOTA-ANCP-PSMA的脂水分配系數(shù)-1.36[17]相比，親脂性相似。與68Ga-PSMA-617脂水分配系數(shù)-2.00[12]相比，具有更高的親脂性，符合結(jié)構(gòu)設(shè)計的預(yù)期。

2.5 正常鼠生物分布結(jié)果

68Ga-DOTA-ANCP-PSMA在正常小鼠的生物分布結(jié)果列入表1。由表1可知：在15 min內(nèi)，血液中的放射性攝取達到最高值，血液清除較快；標(biāo)記物主要通過腎臟代謝，在15、30 min時腎臟的放射性攝取達到(135.54±8.36)%ID/g、(61.11±5.29)%ID/g；肝臟的放射性攝取較低，15、30 min時的放射性攝取僅有(2.10±0.20)%ID/g、(1.67±0.72)%ID/g，腎臟攝取達到肝臟的20～50倍，該化合物在體內(nèi)代謝速度較快；在心臟、肺、脾、胰腺、胃、小腸、大腸中放射性攝取均較低，低于血液攝取；肌肉、骨等非靶組織等的攝取也較低，可以保證腫瘤顯像時的低背景水平。膀胱中有一定的攝取，這是由于標(biāo)記物主要通過尿液排泄，膀胱顯示出較高的攝取值。腎臟的高攝取符合PSMA小分子抑制劑親水性好的特點。

表1 68Ga-DOTA-ANCP-PSMA的正常小鼠生物分布Table 1 Biodistribution of 68Ga-DOTA-ANCP-PSMA in normal mice

2.6 荷瘤裸鼠生物分布結(jié)果

68Ga-DOTA-ANCP-PSMA在荷瘤裸鼠體內(nèi)分布結(jié)果列入表2。由表2可知：68Ga-DOTA-ANCP-PSMA在血液中清除較快，主要通過腎臟代謝，肝臟的放射性攝取較低，在心臟、肺、脾、胰腺、胃、小腸、大腸中放射性攝取均較低，遠低于血液中的值；肌肉、骨等的放射性攝取也較低，代謝的速度與特點基本與正常小鼠的生物分布結(jié)果一致。在腫瘤中有較高的攝取，在5、15、30 min的放射性攝取值分別可達(11.51±1.12)、(6.13±0.75)、(2.30±0.06)%ID/g，隨著時間變化，腫瘤的放射性攝取有一定下降，在5 min左右攝取達到最高值，之后逐漸開始降低。這些生物分布的特點符合68Ga半衰期短的特點，有利于在短時間內(nèi)完成PET-CT掃描。

表2 68Ga-DOTA-ANCP-PSMA的荷瘤裸鼠生物分布Table 2 Biodistribution of 68Ga-DOTA-ANCP-PSMA in nude mice bearing LNCaP

68Ga-DOTA-ANCP-PSMA的靶/非靶比列入表3。由表3可知：瘤/血比在15 min時達到最高，為0.71；瘤/肌肉比和瘤/骨比均較高，15 min時達到最高，分別達到3.41和2.26，15 min后隨著時間延長而逐漸降低。

表3 68Ga-DOTA-ANCP-PSMA的靶/非靶比Table 3 Target/non-target ratio of 68Ga-DOTA-ANCP-PSMA

2.7 PET-CT顯像結(jié)果

15 min時，68Ga-DOTA-ANCP-PSMA 在荷LNCaP裸鼠上進行的PET-CT顯像結(jié)果示于圖7。由圖7可知：標(biāo)記物在膀胱、腎臟有較高攝取，在肝、肺、脾臟等器官均有一定的攝取，與裸鼠的體內(nèi)分布實驗結(jié)果一致；在心臟位置攝取較高，這是由于該時相血藥濃度較高，血液中的攝取導(dǎo)致在心臟位置的影像，顯示高攝??；在腫瘤位置有明顯的攝取。在阻斷顯像實驗中，可以看到在腎臟、膀胱仍有較高攝取，在其它器官攝取較少，在腫瘤位置無攝取。該藥物的特異性和靈敏度較好。

(a)、(c)——注射1.85 MBq 68Ga-DOTA-ANCP-PSMA；(b)、(d)——注射1.85 MBq 68Ga-DOTA-ANCP-PSMA和抑制劑0.05 mg 2-PMAP；(a)、(b)——注射15 min后顯像；(c)、(d)——注射60 min后顯像圖7 68Ga-DOTA-ANCP-PSMA在荷瘤裸鼠的PET-CT顯像Fig.7 PET-CT imaging of 68Ga-DOTA-ANCP-PSMA in nude mice bearing LNCaP after injection

60 min的顯像結(jié)果顯示，68Ga-DOTA-ANCP-PSMA在荷瘤裸鼠體內(nèi)主要分布在腎臟和膀胱，與動物分布實驗結(jié)果一致，該化合物主要通過腎臟排泄。在其它非靶器官攝取較低，在腫瘤部位有較高攝取，可以清晰看到腫瘤的位置。在阻斷實驗中，荷瘤裸鼠體內(nèi)的腫瘤攝取較低，其它器官攝取與非阻斷模型一致。在該時相下，由于非靶器官和組織攝取降低，腫瘤攝取明顯，適合在此時相進行PET-CT的顯像診斷，具有較好的靈敏度和代謝周期。

3 小 結(jié)

68Ga標(biāo)記的68Ga-DOTA-ANCP-PSMA具有標(biāo)記速率快、標(biāo)記率高的特點，20 min可完成標(biāo)記與純化，放射化學(xué)純度大于95%。標(biāo)記物穩(wěn)定性好，在2 h內(nèi)放射化學(xué)純度保持在95%左右，并且有較好的親水性。68Ga-DOTA-ANCP-PSMA主要通過腎臟排泄，其它非靶器官的放射性攝取均較低，在腫瘤中有一定的攝取。在PET-CT的診斷研究中，顯示出較好的靈敏度和特異性，腫瘤位置影像清晰，除了腎臟和膀胱外，其它器官和組織的放射性攝取均較低。68Ga-DOTA-ANCP-PSMA在注射15 min后腫瘤已有較高的放射性攝取，但由于非靶器官的放射性攝取和血液濃度較高，影響PET-CT圖像效果，選擇在注射60 min后進行顯像，可以獲得清晰的影像。68Ga-DOTA-ANCP-PSMA具有較好的體內(nèi)外性質(zhì)，有望成為新型的前列腺癌特異性靶向診斷試劑。