劉張淮，王家軍，張熒熒，朱春艷，王曉英

（寶應(yīng)縣水生動(dòng)物疫病與預(yù)防控制中心，江蘇 寶應(yīng) 225800）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）俗稱淡水小龍蝦，屬十足目，螯蝦科，原螯蝦屬，該蝦晝伏夜出，喜歡棲息于靜水或緩流水體的水草茂盛處[1]?？耸显r廣泛分布于我國江蘇、安徽等地，現(xiàn)已成為我國養(yǎng)殖范圍最廣的淡水螯蝦養(yǎng)殖種類[2-3]。然而，隨著我國克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖熱潮興起，相關(guān)病害的發(fā)生也越來越普遍，國內(nèi)外有許多關(guān)于克氏原螯蝦病原的報(bào)道，主要病原有嗜水氣單胞菌[4]、螺原體[5]和白斑綜合征病毒[6-8]等。

2020年4月，江蘇寶應(yīng)一家龍蝦養(yǎng)殖場發(fā)生克氏原螯蝦爛尾病，患病蝦可以正常攝食，除尾扇部分潰爛外，體表無明顯病變。為防止病害的繼續(xù)發(fā)展，作者立即組織相關(guān)人員采集病蝦樣本，帶回實(shí)驗(yàn)室作進(jìn)一步研究。

1 材料和方法

1.1 樣品

患病蝦采集于揚(yáng)州市寶應(yīng)縣某龍蝦養(yǎng)殖場，平均體質(zhì)量20 g左右，體長10 cm左右。

1.2 試劑與儀器

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；革蘭氏染色試劑盒；動(dòng)物用藥敏分析試劑板；Protease K、2K DNA Marker、ddH2O 和 2×EasyTay PCR SuperMix；DNA提取試劑盒。

BX53光學(xué)顯微鏡、SHP-160型生化培養(yǎng)箱、THZ-82B型空氣搖床、潔凈工作臺、細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)；干式恒溫器、MIKRO200R型臺式高速冷凍離心機(jī)、S1000型PCR儀、BG-Power 600型電泳儀、INFINITY-3026型凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 細(xì)菌分離

用無菌接種針蘸取病蝦尾部病灶部位于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，于30℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，進(jìn)行3次分離純化，得到兩株優(yōu)勢菌。同時(shí)，將分離出的菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于30℃空氣搖床中過夜培養(yǎng)，保存菌液。

1.4 形態(tài)觀察和細(xì)菌初步鑒定

觀察培養(yǎng)基平板上菌落形態(tài)，對分離出的兩株優(yōu)勢菌進(jìn)行革蘭氏染色，于1 000倍光學(xué)顯微鏡下觀察，比較菌株形態(tài)差異。使用細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)對分離出的兩株細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。

1.5 DNA提取

收集菌液，12 000 r/min離心2 mins，棄去上清，然后按照DNA提取試劑盒操作說明提取細(xì)菌DNA。

1.6 16S rRNA基因測序和分析

使用16S rRNA通用引物F（5’-AAACTCAAAG GAATTGACGG-3’）和 R（5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’）對提取出的細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，參考彭宣憲等人方法[9]。PCR反應(yīng)體系25 μL：模板1 μL，正反向引物各 1 μL，SuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性 3 s、56 ℃退火 15 s、72 ℃延伸 10 s，35次循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一部分進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，另一部分送往上海生工生物股份有限公司進(jìn)行16S rRNA基因測序。

1.7 藥敏試驗(yàn)

使用動(dòng)物用藥敏分析試劑板檢測兩種細(xì)菌對8種常見抗生素的藥物敏感性，藥敏結(jié)果判定參照《抗微生物敏感試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》（CLSI）[10]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

從患爛尾病克氏原螯蝦尾部病灶分離出兩株細(xì)菌，分別編號為S1和S2。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示，菌株S1菌落為圓形，淡黃色，直徑約為1~2 mm；S2菌落為圓形，灰白色，直徑約為1~2 mm。S1和S2均為革蘭氏陰性，短桿狀。

圖1 菌株S1和S2的形態(tài)特征

2.3 細(xì)菌初步鑒定結(jié)果

將S1和S2兩種菌株接種到生化反應(yīng)板中，30℃培養(yǎng)24 h后，使用細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果如表1所示，通過相關(guān)理化反應(yīng)，S1初步鑒定為嗜水氣單胞菌，S2為弗氏檸檬酸桿菌。

2.4 16S rRNA基因測序結(jié)果

如圖2所示，菌株基因片段大小為520 bp左右，與理論值一致。同時(shí)將16S rRNA基因序列提交BLAST進(jìn)行比對，與部分模式菌株比對結(jié)果如表2所示，菌株S1與嗜水氣單胞菌相似性為99.36%，S2與弗氏檸檬酸桿菌相似性為100%，綜合上述結(jié)果，可確定菌株S1為嗜水氣單胞菌，菌株S2為弗氏檸檬酸桿菌。

表1 菌株S1和S2的初步鑒定

圖2 16S rRNA基因序列擴(kuò)增結(jié)果

2.5 藥敏試驗(yàn)

如表3所示，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明兩種菌株均對恩諾沙星和硫酸新霉素高度敏感，對磺胺類藥物均不敏感。此外，S1對甲砜霉素、氟苯尼考和鹽酸多西環(huán)素高度敏感；S2對氟苯尼考和鹽酸多西環(huán)素中度敏感。

表2 菌株S1和S2的16S rRNA基因序列比對相似性

表3 菌株S1和S2的藥敏特性

3 討論

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）為弧菌科氣單胞菌屬，是一種革蘭氏陰性菌，可以引起多種淡水養(yǎng)殖魚類感染，包括草魚、鰱、鳙、鯽、鳊、鯉等。由嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌性敗血癥已成我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害淡水魚種類最多、分布地域最廣、流行季節(jié)最長、造成損失最大的一種急性傳染病[3，11]。隨著近幾年甲殼動(dòng)物，如蝦、蟹人工養(yǎng)殖的增多，甲殼動(dòng)物感染嗜水氣單胞菌引起大批死亡的報(bào)道也越來越多，如2010年，浙江安吉克氏原螯蝦養(yǎng)殖死亡嚴(yán)重，經(jīng)細(xì)菌分離鑒定，病原菌為嗜水氣單胞菌[4]；2010年，嗜水氣單胞菌引起汕頭市牛田洋水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)鋸緣青蟹患病死亡[12]。

弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）為腸桿菌科枸櫞酸桿菌屬，是一種革蘭氏陰性菌，常見于糞便和尿液中，可以作為一種糞便污染的微生物學(xué)指標(biāo)[13]。弗氏檸檬酸桿菌作為人類腸道中的正常菌群，是一種兼性厭氧的條件致病菌，最早報(bào)道與人的腹瀉有關(guān)[14]。近年來，在魚類和蝦蟹類養(yǎng)殖上也有報(bào)道，如2016年，柳州市柳城縣一家養(yǎng)殖場羅非魚大量死亡，經(jīng)鑒定后確定病原菌為弗氏檸檬酸桿菌[15]；2012年，弗氏檸檬酸桿菌引起安徽省全椒縣兩家克氏原螯蝦稻田養(yǎng)殖場爆發(fā)性死亡[16]。

嗜水氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌都是水產(chǎn)動(dòng)物病害的常見病原，廣泛存在于自然水體中。本實(shí)驗(yàn)對春季克氏原螯蝦爛尾病進(jìn)行了基礎(chǔ)性探索，具體關(guān)于克氏原螯蝦爛尾病的病原菌判定還需要后續(xù)的深入研究。

4 結(jié)論

目前，作者從克氏原螯蝦爛尾病灶處分離出嗜水氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌兩種細(xì)菌，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中可以使用恩諾沙星和硫酸新霉素對其進(jìn)行防治。