李慧，李宇飛，孟子育，郁家寶，趙永正，夏倩倩，孟超，田園

（山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271016）

螭霖魚（Varicorhinus macrolepis），屬鯉科，國家二級保護(hù)動物，野生群體僅分布在泰山部分溪流中。其富含豐富的礦物質(zhì)、微量元素，具有較高的營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價值。近年來，由于水質(zhì)變化及化學(xué)藥物使用等因素，養(yǎng)殖螭霖魚種群中出現(xiàn)抗病力下降、病死率增加現(xiàn)象。如何提高魚群的生態(tài)健康發(fā)展，是目前要面對的主要問題。

魚類腸道是魚體內(nèi)接于食道（無胃魚）或胃（有胃魚）后，止于肛門的一種管狀消化器官[1]，主要負(fù)責(zé)消化和吸收，也參與體內(nèi)的免疫反應(yīng)、新陳代謝和多種應(yīng)激反應(yīng)[2]。那些與魚類存在共生關(guān)系或協(xié)同進(jìn)化關(guān)系的魚類腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)龐大而復(fù)雜，包含許多不同種類的細(xì)菌，多由好氧菌、兼性厭氧菌和專性厭氧菌組成，是一個大型動態(tài)菌群。對于大多數(shù)魚類來說，穩(wěn)定的腸道微生物區(qū)系對多種宿主功能都有影響[3]。腸道菌群的生態(tài)穩(wěn)定，對輔助機(jī)體進(jìn)行消化吸收、幫助機(jī)體抵御外界病毒害、調(diào)節(jié)宿主的免疫機(jī)能等有重要作用[4-5]。在漫長的進(jìn)化過程中，機(jī)體與菌群聯(lián)系外界環(huán)境，形成了一個穩(wěn)定的整體，共同進(jìn)化，互利互惠，使腸道菌群也成為了魚類健康生長繁殖的中的保障因素，如果菌群失衡，將有可能導(dǎo)致各類疾病的產(chǎn)生，最終影響機(jī)體健康。

Han[6]和王純[7]曾分別采用過克隆文庫的方法和DGGE技術(shù)對草魚的腸道微生物進(jìn)行過探索。DGGE和基因克隆技術(shù)簡單高效，但檢測限低，具有較大局限性，更適合反映細(xì)菌群落的優(yōu)勢種群，尚不能全面系統(tǒng)地揭示細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性[8]。近年來，高通量測序技術(shù)因其特異性高、準(zhǔn)確率高和測序數(shù)據(jù)量大的特點在魚類腸道微生物群落研究中得到廣泛應(yīng)用[9-12]。目前關(guān)于螭霖魚腸道菌群的研究鮮見報道。

該研究采用16 S擴(kuò)增子測序平臺NovaSeq PE250對螭霖魚腸道微生物DNA進(jìn)行測序，有利于低豐富群落物種的鑒定，從而提高螭霖魚腸道微生物群落研究的精準(zhǔn)性。這將為螭霖魚腸道菌群的多樣性及協(xié)同進(jìn)化關(guān)系研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試魚

試驗采用的螭霖魚來自山東省泰安市彩石溪養(yǎng)殖場。水體溫度控制在18~22℃。螭霖魚每天喂食兩次。螭霖魚的喂食以活魚蟲（含枝角類、撓足類和搖蚊幼蟲等）為主，輔以人工配合飼料。人工配合飼料配方為：進(jìn)口魚粉44.7%，優(yōu)質(zhì)豆粉22.9%，玉米粉29.4%，氨基酸強(qiáng)化營養(yǎng)素3%，維生素添加劑0.03%，微量元素添加劑0.05%。

1.2 主要試劑及儀器

無水乙醇，Goldview，蛋白酶K，去離子水，RNase，瓊脂糖，糞便基因組DNA提取試劑盒（Solarbio），PCR Buffer10組，MgCl22.5mM，dNTP mixture 2.5mM，TaqE 2.5 U/μL 和 5.0 U/μL（寶生物工程有限公司），滅菌無離子水，引物（5 pm/μL）。

1.3 樣品采集

隨機(jī)挑取3條健康無損的螭霖魚（魚齡1年），體長8~12 cm，饑餓處理24 h。置于超凈工作臺中，使用75%酒精擦拭白甲魚體表后用蒸餾水漂洗；解剖魚體，將其腸道分離并置于高壓滅菌后的培養(yǎng)皿中；將小腸縱向剪開，用滅菌手術(shù)刀片將小腸內(nèi)壁粘膜緩慢刮下來，置于1.5 mL離心管中，即為小腸腸道內(nèi)容物樣品，最后放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用CTAB或SDS方法對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。采用引物515F（5′-GTGCCAGCMG CCGCGGTAA-3′）和 806R（5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V4區(qū)。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：5×Phusion○RHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 4 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，TransStart○RFastPfu DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，樣品 DNA 2 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃ 1 min；98 ℃10s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30s，30 個循環(huán)；72 °C 5min。測序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.5 生物信息學(xué)的分析

用 Qiime軟件（Version 1.9.1）[13]計算相關(guān)指數(shù)，使用R軟件（Version 2.15.3）繪制物種多樣性曲線。利用UPARSH軟件對樣本的全部有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，默認(rèn)97%的一致性將序列聚類為OUTs（Operational Taxonomic Units）；利用Mothur方法和SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫對OUTs代表序列進(jìn)行物種注釋；利用MUSCLE軟件進(jìn)行快速多序列比對以獲得所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 測序概述

該次數(shù)據(jù)結(jié)果如表1所示，過濾嵌合體后，最終用于后續(xù)分析的Tags序列平均長度為253 bp。3個樣本共得到250 958條序列，單個樣本序列范圍為80 895~86 112條，其中質(zhì)控后可用于后續(xù)分析的有效序列共192 784條，單個樣本序列范圍為62 117~68 449條。

表1 樣品QC之后序列統(tǒng)計總表

2.2 物種多樣性曲線

對所得有效數(shù)據(jù)構(gòu)建稀釋曲線（圖1A）和等級聚類曲線（圖1B）。從圖1A中可以看出，稀釋曲線逐漸趨于平穩(wěn)，說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，加大數(shù)據(jù)量，基本上不會再產(chǎn)生較多的新物種數(shù)（OTUs）。由圖1B可以看出，曲線在水平方向的橫軸上跨度較大，說明物種豐富度高；在垂直方向上曲線坡度較大，說明物種分布不均勻。

2.3 Alpha Diversity指數(shù)分析

由Alpha多樣性分析可知，3個重復(fù)樣本的物種豐富度和均勻度上存在較小的差異，3個樣品OTU的覆蓋率分別為99.8%，99.9%和99.9%（表2所示），說明樣品中有未被測出的序列的概率較低，測序數(shù)量已飽和，能夠真正反應(yīng)赤鱗魚腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)及組成多樣性。對比3個3個樣品，R.S.1的chao1指數(shù)最高為740.615，表明R.S.1的物種豐富度最大。同時發(fā)現(xiàn)R.S.2的Shannon指數(shù)最高，R.S.3最低，由此可見R.S.2和R.S.3群落物種多樣性存在差異。

2.4 螭霖魚腸道中在主要細(xì)菌群落分布

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個樣本或分組在各分類水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖（圖2）。如圖2A所示，在門水平上，擬桿菌門（Bacteroidetes）（46.96%）、變形菌門（Proteobacteria）（48.70%）占據(jù)優(yōu)勢地位，其次為厚壁菌門（Firmicutes）（37.38%），其他細(xì)菌門類占比較少。在科水平上，如圖2B所示，黃桿菌科（Flavobacteriaceae）占優(yōu)勢地位，伯克氏菌科（Burkholderiaceae）和氣單胞菌科（Aeromonadaceae）豐度較高，假單胞菌科（Pseudomonadaceae）等其他類別的相對豐度不足1%。在屬水平上，如圖2C所示，黃桿菌屬（Flavobacterium）（44.72%）、藍(lán)黑紫色桿菌屬（Janthinobacterium）（9.39%）和氣單胞菌屬（Aeromonas）（9.29%）的豐度較高，為優(yōu)勢菌種，尤其是黃桿菌屬（Flavobacterium）在屬水平上占據(jù)最優(yōu)勢地位。其他所占比例較少。

圖1 稀釋曲線（A）和等級聚類曲線（B）

表2 赤鱗魚腸道菌群Alpha多樣性統(tǒng)計表

圖2 螭霖魚腸道中細(xì)菌在門（A）、科（B）、屬（C）水平中的相對豐度柱形圖

2.5 特定物種分類樹組成分析

對每個樣本或每個分組的物種分類結(jié)果進(jìn)行物種分類樹[14]統(tǒng)計（圖3）。從圖3可以看出，螭霖魚腸道菌群所含細(xì)菌種類主要分布在類桿菌門（Bacteroidia）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）3個門，其中類桿菌門約占57.44%，占絕對優(yōu)勢；從綱的分類水平來看,以類桿菌綱（Bacteroidia）為主，占57.44%；在目的水平上，以黃桿菌目（Flavobacterium）為優(yōu)勢目，占比57.44%。在屬的水平上，以黃桿菌屬（Flavobacterium）和藍(lán)黑紫色桿菌屬（Janthinobacterium）為優(yōu)勢屬，其中黃桿菌屬（Flavobacterium）占比55.94%，兼具主要優(yōu)勢。

圖3 螭霖魚特定物種分類樹

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步研究屬水平物種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，通過多序列比對得top100屬的代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，結(jié)果見圖4。由圖4可知，類桿菌屬（Bacteroidia），變形菌屬（Proteobacteria）和黃桿菌屬（Flavobacterium）相對豐度較高，且系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系比較接近。其次是梭菌屬（Clostridia）和異常球菌-棲熱菌屬（Deinococcus-Thermus）在系統(tǒng)進(jìn)化上較為接近。圖4中樹形表現(xiàn)出多個分支，但最終聚為一支，說明這些物種在進(jìn)化上基本趨于一致。

圖4 屬水平物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

3 討論

本實驗采用高通量測序技術(shù)的方法，選取了三條螭霖魚作為樣本，提取其腸道內(nèi)容物的微生物DNA，并進(jìn)行微生物多樣性分析。通過對稀釋曲線的測定可知，曲線已達(dá)到飽和，說明樣品測序量足夠且合理，能夠反應(yīng)其腸道微生物多樣性及結(jié)構(gòu)組成。

試驗結(jié)果表明，3個樣本共得到250 958條序列?；?7%的樣本相似度，樣本優(yōu)化聚類為1200個 out（Operational taxonomical unit），共涉及 13 門24綱42目56科75屬。在門水平上，擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）為螭霖魚腸道的優(yōu)勢菌門，這與文獻(xiàn)中記載的其他鯉科生物，如草魚、鰱魚、團(tuán)頭魴、鯉魚等腸道的優(yōu)勢菌門及含量有略有差異[15]。相關(guān)研究表明，厚壁菌門最主要的功能是降解纖維類物質(zhì)，而擬桿菌門主要降解非纖維物質(zhì)，厚壁菌門和擬桿菌門在動物腸道的相對比例與宿主的食性和代謝息息相關(guān)[16-17]，進(jìn)而推測腸道菌群對螭霖魚豐富的營養(yǎng)價值及獨特的生存環(huán)境有重要影響。在科水平上，黃桿菌科（Flavobacteriaceae）占優(yōu)勢地位，伯克氏菌科（Burkholderiaceae）和氣單胞菌科（Aeromonadaceae）豐度較高，其他菌如假單胞菌科（Pseudomonadaceae）等相對豐度不足1%。在屬水平上黃桿菌屬（Flavobacterium），藍(lán)黑紫色桿菌屬（Janthinobacterium）和氣單胞菌屬（Aeromonas）為主要優(yōu)勢菌種，其次是假單胞菌屬（Pseudomonas）,芽孢桿菌屬（Bacillus）希瓦氏菌屬（Shewanella），伊麗莎白桿菌屬（Elizabethkingia），馬賽菌屬（Massilia）和嗜血桿菌屬（Haemophilus）。其中黃桿菌屬（Flavobacterium）豐度最高，占絕對優(yōu)勢所占比例為44.72%，該菌為嚴(yán)格好氧菌，培養(yǎng)溫度應(yīng)低于30℃，這說明該菌對螭霖魚生存水域的溫度和溶氧量有嚴(yán)格要求，這可能是其較難養(yǎng)殖的原因之一。此外，黃桿菌屬（Flavobacterium）對降解殺蟲劑中主要成分甲氰菊酯具有一定的作用，這說明樣本所生活的水域系統(tǒng)已遭到一定的破壞。藍(lán)黑紫色桿菌屬（Janthinobacterium）會產(chǎn)生化合物——紫色桿菌素，具有抗革蘭陽性菌和植物致病菌的作用[18]，由此推測螭霖魚腸道攜帶藍(lán)黑紫色桿菌可以使其在污染的水體環(huán)境中存活。芽孢桿菌屬與螭霖魚互利共生，螭霖魚為其提供寄生環(huán)境，并提供其正常生命活動所需的營養(yǎng)物質(zhì)，而芽孢桿菌在腸道中能分泌很多活性很強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，有助于降解植物性飼料中某些復(fù)雜的碳水化合物，拮抗腸道內(nèi)的氧氣，以維持其腸道的生態(tài)平衡。芽孢桿屬因其無毒性，能分泌多種酶類，生命過程能以孢子體形式存在，耐高溫等能力強(qiáng)等優(yōu)點，可對螭霖魚腸道內(nèi)該菌屬進(jìn)一步分離研究，將其作為微生態(tài)添加劑，這對于螭霖魚的養(yǎng)殖保護(hù)有廣闊前景。

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹，樹形表現(xiàn)出多個分支，但最終聚為一支，推斷這些物種在進(jìn)化上基本趨于一致。結(jié)果顯示，類桿菌屬（Bacteroidia），變形菌屬（Proteobacteria）和黃桿菌屬（Flavobacterium）相對豐度較高，且系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系比較接近。其次是梭菌屬（Clostridia）和異常球菌-棲熱菌屬（Deinococcus-Thermus）在系統(tǒng)進(jìn)化上較為接近。這表明，螭霖魚腸道種微生物群落組成較為相似，無顯著差異。綜上，該菌群所含種類豐富，群落結(jié)構(gòu)遺傳進(jìn)化較為穩(wěn)定?？赡苁怯捎谔┥降貐^(qū)位于多河交匯處，自然條件適合螭霖魚的生存，經(jīng)長期演變，形成獨特的珍稀物種。但由于氣候因素和人為因素影響，該地區(qū)水域生態(tài)系統(tǒng)遭受一定程度的破壞。

研究表明，腸道菌群的結(jié)構(gòu)和數(shù)量受多種因素的影響，包含食物組成、環(huán)境因素、生理狀態(tài)和遺傳因素等[19-22]，進(jìn)而影響機(jī)體的營養(yǎng)吸收、消化代謝、免疫調(diào)控等。該研究充分發(fā)揮了16 S擴(kuò)增子測序平臺NovaSeq PE 250的優(yōu)勢，高效避免了不可培養(yǎng)菌群的不可測性，最大限度的測量了腸道菌群的結(jié)構(gòu)和豐度，深入剖析了螭霖魚腸道共生微生物的多樣性并對部分共生微生物的功能，為研究螭霖魚共生細(xì)菌與宿主之間的相互關(guān)系以及今后魚類資源的安全開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

通過螭霖魚腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與組成多樣性，可以發(fā)現(xiàn)其群落結(jié)構(gòu)和組成相似，無顯著差異，并且群落結(jié)構(gòu)的進(jìn)化較為穩(wěn)定；但螭霖魚腸道微生物結(jié)構(gòu)與其他魚類，如鯉、草魚、鰱、團(tuán)頭魴等有顯著差異，這可能與其獨特的生存環(huán)境、攝食種類、生活習(xí)性有關(guān)。該試驗中樣品中提取到的螭霖魚腸道微生物在高豐度菌群組成上是一致的，但在低豐度菌群中，其組成具有較大差異，提示高通量測序?qū)ち佤~不同生物重復(fù)中高豐度菌群的組成上具有很好的重復(fù)性，但在低豐度菌群上尚需進(jìn)一步研究。