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        EPF單抗聯(lián)合順鉑對(duì)家畜膀胱腫瘤抑瘤效果的影響

        2020-08-19 12:51:38鐘永怡周泉蘇立杰練玉銀王家驥陳驍熠
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年9期
        關(guān)鍵詞:順鉑家畜

        鐘永怡 周泉 蘇立杰 練玉銀 王家驥 陳驍熠

        摘要:為觀察早孕因子單克隆杭體(EPF-McAb)聯(lián)合順鉑(DDP)對(duì)膀胱癌細(xì)胞EJ裸鼠移植瘤的抑制作用,常規(guī)將EJ細(xì)胞接種于裸鼠右側(cè)背部皮下,待腫瘤長至直徑約5mm時(shí)隨機(jī)分為4組,每組5只,即空白對(duì)照組、順鉑組、低劑量單杭聯(lián)合組和高劑量單杭聯(lián)合組。定期測(cè)量裸鼠腫瘤體積,繪制腫瘤生長曲線。給藥2周后處死裸鼠,剝?nèi)∧[瘤,稱瘤重,計(jì)算抑瘤率。通過蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色觀察細(xì)胞病理學(xué)改變;免疫印跡法檢測(cè)早孕因子(EPF)的表達(dá)情況。結(jié)果表明,順鉑組、低劑量單杭聯(lián)合組和高劑量單杭聯(lián)合組裸鼠移植瘤生長速度均慢于空白對(duì)照組。與順鉑組比較,低劑量單杭聯(lián)合組和高劑量單杭聯(lián)合組裸鼠末次給藥的移植瘤體積分別為(131.05±8.26)和(97.92±7.35)mm3。低劑量單杭聯(lián)合組抑瘤率(35.78%)和高劑量單杭聯(lián)合組抑瘤率(53.04%)均高于順鉑組抑瘤率(22.36%),差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)。與空白對(duì)照組比較,單杭聯(lián)合組裸鼠EPF蛋白的表達(dá)量下降(P<0.05)。表明EPF-McAb聯(lián)合順鉑可抑制膀胱癌細(xì)胞EJ在裸鼠體內(nèi)增殖,其機(jī)制可能通過抑制EPF的表達(dá)發(fā)揮作用。

        關(guān)鍵詞:早孕因子單克隆杭體(EPF-McAb);順鉑;膀脫腫瘤;家畜

        中圖分類號(hào):R739.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

        文章編號(hào):0439-8114(2020)09-0133-04

        DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.09.028

        一般來說,動(dòng)物的膀胱腫瘤是比較罕見的,然而在世界的某些地區(qū)牛、羊等家畜的膀胱腫瘤卻比較多見[1]。家畜中的膀胱癌是一種分化程度較低、具有高度浸潤轉(zhuǎn)移能力、預(yù)后差的惡性腫瘤[2,3]。大多數(shù)患有膀胱腫瘤或者尿道腫瘤的家畜都會(huì)出現(xiàn)血尿、尿頻、痛性尿淋漓或排尿困難等癥狀,其他癥狀包括尿失禁、多尿、煩渴和呼吸困難等[4,5]。早孕因子(EPF)是在妊娠早期哺乳動(dòng)物血清中存在的一種分泌性蛋白,由澳大利亞學(xué)者M(jìn)orton在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)并命名[6]。EPF不僅是正在分裂的胚胎和腫瘤組織的產(chǎn)物[7-9],也是正在增殖的細(xì)胞的產(chǎn)物,胚胎和腫瘤的生長存活均有賴于EPF。因此,EPF具有免疫抑制活性、生長調(diào)節(jié)活性和免疫逃逸作用[10-12]。關(guān)于早孕因子單克隆抗體(EPF-McAb)聯(lián)合順鉑(DDP)在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)膀胱癌抑制作用的研究少見報(bào)道,本試驗(yàn)通過建立膀胱癌裸鼠移植瘤模型,研究EPF-McAb聯(lián)合DDP的抗家畜膀胱腫瘤效應(yīng)并初步探討其作用機(jī)制,為EPF-McAb在家畜膀胱腫瘤治療中的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 細(xì)胞株、動(dòng)物及主要材料

        人膀胱癌細(xì)胞EJ,中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;6周齡SPF級(jí)BALB/c雄性裸鼠,廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK(粵)2013-0034]:順鉑,齊魯制藥有限公司;胎牛血清、DMEM及0.25%胰酶,Gibco公司;細(xì)胞裂解液、PMSF,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG,北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;蘇木素,南京建成生物工程研究所有限公司;ECL發(fā)光液,美國millipore公司;β-actin抗體,Abeam公司:倒置顯微鏡,德國Leica公司;凝膠成像分析系統(tǒng),美國Azure公司。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物飼養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中,置于37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。BALB/c裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體(Specific pathogen free,SPF)環(huán)境中。

        1.2.2 動(dòng)物模型的建立、分組及給藥 無菌環(huán)境下取對(duì)數(shù)生長期的EJ細(xì)胞0.25%胰酶消化后,制成密度為5×107個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液,用注射器取0.2mL接種于裸鼠右側(cè)背部皮下。7d后可見有移植瘤生長,隨后每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠移植瘤直徑,待腫瘤長至直徑約5mm后,將20只裸鼠隨機(jī)分成4組,即空白對(duì)照組(生理鹽水)、順鉑組(2mg/kg DDP)、低劑量單抗聯(lián)合組(100μgEPF-McAb和2mg/kgDDP)、高劑量單抗聯(lián)合組(300μgEPF-McAb和2mg/kg DDP),每組5只。尾靜脈注射,隔天給藥,共給藥4次。

        1.2.3 繪制腫瘤生長曲線 分組后每2d測(cè)量腫瘤直徑1次,記錄移植瘤的最大徑(a)和最小徑(b),計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積(mm3)=長徑(a)×短徑(b)2×π/6,記錄至試驗(yàn)結(jié)束。根據(jù)各組腫瘤體積的平均值繪制腫瘤生長曲線。

        1.2.4 計(jì)算抑瘤率 最后一次給藥后第10天,頸椎脫臼法處死全部裸鼠,剝離瘤體并稱瘤重,計(jì)算腫瘤的抑瘤率。抑瘤率=(1-治療組平均瘤質(zhì)量/空白組平均瘤質(zhì)量)×100%。

        1.2.5 組織形態(tài)學(xué)觀察 切取腫瘤后,立即固定于10%中性甲醛溶液中,梯度乙醇脫水、二甲苯透明,常規(guī)包埋蠟塊,切片進(jìn)行HE染色,光鏡下觀察腫瘤細(xì)胞數(shù)目、密度及壞死情況。

        1.2.6 蛋白印跡試驗(yàn) 分別收集空白組和試驗(yàn)組細(xì)胞提取總蛋白,BCA法檢測(cè)總蛋白濃度,加入loading buffer混合后沸水浴變性,經(jīng)15%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉2h,EPF-McAb稀釋度為1:1000,室溫中孵育2h后洗膜,二抗孵育膜1h,再次洗膜后采用ECL在暗室中顯色,X光膠片記錄陽性條帶,掃描后用gel pro 4.0軟件分析陽性條帶灰度值,以EPF與β-actin灰度值的比值為EPF蛋白相對(duì)表達(dá)量。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行處理分析。所有計(jì)量資料均符合正態(tài)分布,以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤(x±s)表示;計(jì)量資料間比較,在確定方差齊性后(P>0.05),采用單因素方差分析(One-way ANO-VA),各組間的多重比較采用Bonferroni法;如果方差不齊(P<0.05)則采用Welch法,組間多重比較采用Dunnett's T3法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 裸鼠移植瘤體積和腫瘤生長情況

        由圖1可見,接種后,各治療組移植瘤均表現(xiàn)為體積增大,呈局部結(jié)節(jié)狀生長??瞻讓?duì)照組、順鉑組、低劑量單抗聯(lián)合組和高劑量單抗聯(lián)合組裸鼠腫瘤體積平均分別為(1071.40±116.31)、(831.05±53.24)、(702.13±29.75)和(503.59±47.81)mm3。順鉑組、低劑量單抗聯(lián)合組和高劑量單抗聯(lián)合組裸鼠的移植瘤生長速度均顯著慢于空白對(duì)照組(P<0.05)。

        2.2 裸鼠腫瘤質(zhì)量和抑瘤率

        最后一次給藥后第10天處死裸鼠,解剖見腫瘤表面包膜完整,呈結(jié)節(jié)狀或類圓形,空白對(duì)照組、順鉑組、低劑量單抗聯(lián)合組和高劑量單抗聯(lián)合組裸鼠腫瘤質(zhì)量分別為(2.102±0.141)、(1.632±0.118)、(1.350±0.071)和(0.987±0.056)g;順鉑組、低劑量單抗聯(lián)合組和高劑量單抗聯(lián)合組的抑瘤率分別為22.36%、35.78%、53.04%,與空白對(duì)照組比較差異均顯著(P<0.05)(表1)。

        2.3 HE染色觀察EPF-McAb聯(lián)合順鉑對(duì)裸鼠皮下移植瘤形態(tài)的影響

        鏡檢結(jié)果可見,空白對(duì)照組裸鼠腫瘤細(xì)胞間隙較小,分布均勻,但排列紊亂,具有明顯的核異型性、核分裂多、細(xì)胞核大、胞質(zhì)較少等特點(diǎn)。低劑量單抗聯(lián)合組及高劑量單抗聯(lián)合組與順鉑組相比,病理可見腫瘤細(xì)胞大小不均,細(xì)胞間隙較大,形態(tài)不整,細(xì)胞核固縮,核分裂相對(duì)較少,可見有少量炎性細(xì)胞浸潤,腫瘤細(xì)胞壞死明顯,細(xì)胞增殖被抑制(圖2)。

        2.4 EPF蛋白表達(dá)

        由圖3可見,空白對(duì)照組、順鉑組、低劑量單抗聯(lián)合組和高劑量單抗聯(lián)合組裸鼠EPF蛋白表達(dá)灰度值分別為101.05、75.46、31.37、16.71;順鉑組、低劑量單抗聯(lián)合組和高劑量單抗聯(lián)合組與空白對(duì)照組相比差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)。

        3 小結(jié)與討論

        家畜中的膀胱腫瘤是一種分化程度較低、具有高度浸潤轉(zhuǎn)移能力、預(yù)后差的惡性腫瘤[2,3],家畜疾病的防治工作直接影響?zhàn)B殖戶的收入及養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展水平[13]。研究發(fā)現(xiàn)抗EPF-McAb對(duì)小鼠體內(nèi)移植瘤生長有影響[14],抗EPF-McAb無論在體外或體內(nèi)均可抑制腫瘤的生長[14]。本試驗(yàn)通過建立膀胱癌裸鼠移植瘤模型,尾靜脈給藥后,繪制腫瘤生長曲線,觀察抑瘤效果;通過蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eo-sin,HE)染色觀察細(xì)胞病理學(xué)改變;免疫印跡法檢測(cè)EPF蛋白的表達(dá)情況,了解EPF-McAb聯(lián)合順鉑對(duì)裸鼠膀胱腫瘤的抑瘤效果。結(jié)果表明,EPF-McAb聯(lián)合順鉑可抑制膀胱癌細(xì)胞EJ在裸鼠體內(nèi)增殖,其機(jī)制可能通過抑制EPF蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用,為進(jìn)一步探究家畜膀胱腫瘤的治療奠定了基礎(chǔ)。

        張冬云等[9]在肺癌等多種腫瘤或非腫瘤患者的血清中發(fā)現(xiàn),絨癌、膀胱癌、黑色素瘤、惡性葡萄胎4種腫瘤血清和黑色素瘤標(biāo)本組織液具有t-EPF活性,故猜測(cè)EPF-McAb可能對(duì)膀胱腫瘤有治療作用。在本試驗(yàn)中,隨EPF-McAb劑量的增加腫瘤的體積及質(zhì)量逐漸減小,順鉑組、低劑量單抗聯(lián)合組和高劑量單抗聯(lián)合組的抑瘤率分別為22.36%、35.78%、53.04%,表明不同濃度的EPF-McAb有顯著抑制腫瘤生長的作用,抑瘤效果較順鉑組更為顯著,且隨著EPF-McAb劑量的增加,對(duì)腫瘤的抑制作用逐漸增強(qiáng),抑制作用與濃度呈明顯的相關(guān)性,這與Quinn等[15]的試驗(yàn)結(jié)果一致,表明EPF-McAb對(duì)膀胱癌有很好的治療作用。

        已有較多報(bào)道顯示單抗聯(lián)合臨床藥物對(duì)裸鼠移植瘤的生長有抑制作用。張皓等[16]提出,曲妥珠單抗聯(lián)合吉西他濱可以有效抑制裸鼠移植瘤生長,其機(jī)制可能與下調(diào)Cox-2蛋白表達(dá)有關(guān);此外,梁亮等[17]發(fā)現(xiàn),西妥昔單抗聯(lián)合伊馬替尼可以下調(diào)ATP7A、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá),同時(shí)明顯降低結(jié)腸癌大鼠血清VEGF含量,進(jìn)而影響結(jié)腸癌組織中的能量合成,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖;祝保艷等[18]則表示卡博替尼聯(lián)合PD-L1單抗對(duì)黑色素瘤小鼠移植瘤有抑制作用,這種協(xié)同抗腫瘤作用機(jī)制可能是通過促進(jìn) B16-F10細(xì)胞凋亡及抑制AKT/mTOR通路所致。而在本研究中,EPF-McAb聯(lián)合順鉑可以明顯抑制膀胱癌裸鼠移植瘤的生長,與上述研究結(jié)果一致。

        有研究顯示,EPF-McAb使腫瘤細(xì)胞體外生長受到限制,可能是由于EPF-McAb干擾了維持腫瘤細(xì)胞增殖活性階段的機(jī)制[14]。EPF具有免疫抑制作用,主要抑制淋巴細(xì)胞功能,而且EPF與腫瘤生長有關(guān)[15,19],利用EPF-McAb結(jié)合EPF蛋白,可能減輕EPF對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用,從而抑制EJ細(xì)胞的增殖。故單抗聯(lián)合藥物對(duì)腫瘤的治療具有一定理論和試驗(yàn)依據(jù)。對(duì)于家畜來說,若能科學(xué)地使用和掌握藥物,就能有效地治療家畜養(yǎng)殖中遇到的相關(guān)疾病,有助于家畜的健康成長,并提升其經(jīng)濟(jì)效益[20]。

        綜上所述,本研究結(jié)果表明EPF-McAb聯(lián)合順鉑可抑制膀胱癌細(xì)胞EJ在裸鼠體內(nèi)增殖,其機(jī)制可能通過抑制EPF蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用。本試驗(yàn)結(jié)果為EPF-McAb治療家畜膀胱腫瘤提供了一定的理論依據(jù)。

        參考文獻(xiàn):

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        收稿日期:2019-05-30

        基金項(xiàng)目:廣東省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2008A030201022)

        作者簡介:鐘永怡(1993-),女,廣東清遠(yuǎn)人,在讀碩士研究生,研究方向?yàn)楣残l(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué),(電話)13678920392(電子信箱)zhongyon-gyi1993@163.com;通信作者,王家驥(1955-),男,廣東廣州人,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事全科醫(yī)學(xué)研究,(電話)13926179883(電子信箱)wjiaji@163.com;陳驍熠(1965-),女,廣東廣州人,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事食品與營養(yǎng)衛(wèi)生研究,(電話)18620586562(電子信箱)wwchenxyl@163.com。

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