張 濤， 劉 雪， 陳 鵬

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 武漢 430070)

tRNA是翻譯過程中的核心分子，對遺傳信息的正確解讀起至關(guān)重要的作用。tRNA具有高度保守的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，而且具有大量由4種基礎(chǔ)核苷——U、C、G、A衍化而來的修飾核苷。 這些核苷修飾既可以微妙的方式改變tRNA的局部構(gòu)型，也可以大范圍重組的方式改變tRNA的整體結(jié)構(gòu)[1]。有研究表明，某些修飾的存在可以增加tRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，誘導(dǎo)tRNA的正確折疊[2]。

在所有tRNA核苷修飾類型中，甲基化是最常見的修飾。甲基化幾乎發(fā)生在堿基的所有含氮位置上，此外，核糖的2′-羥基的氧原子、嘧啶第5位C原子、腺苷的第2和第8位的C原子上均可發(fā)生甲基化[3]。這些核苷甲基化修飾是由多種甲基轉(zhuǎn)移酶(Methyltransferase, 或MTase)催化的。目前被鑒定的RNA MTase包括60多個成員，數(shù)百個同源蛋白，歸為4個超家族：1)Rossmann-fold 甲基轉(zhuǎn)移酶(簡稱RFM)[4]；2)SpoU-TRMD 甲基轉(zhuǎn)移酶(簡稱SPOUT 甲基轉(zhuǎn)移酶)[5]；3)Radical-SAM甲基轉(zhuǎn)移酶[6]；4)FAD/NAD(p)-結(jié)合蛋白[7]。

tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶是甲基轉(zhuǎn)移酶中的一種，其命名方式是在Trm或TRMT后加數(shù)字或字母。本文綜述了負(fù)責(zé)tRNA上9位和37位鳥嘌呤N1甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶，探討不同的酶針對不同底物位點的特異性識別機(jī)制。

1 tRNA中的m1G修飾

tRNA分子上普遍存在著修飾核苷，很多轉(zhuǎn)錄后修飾有助于tRNA的正確折疊，而不同位置及不同類型的修飾可以影響tRNA分子的局部結(jié)構(gòu)、整體穩(wěn)定性、酶學(xué)動力學(xué)及最終翻譯過程的解碼能力[8]。其中，反密碼子莖環(huán)附近的修飾會直接影響蛋白質(zhì)翻譯過程的效率和準(zhǔn)確性[9-10]。

N1-methylguanosine(m1G)是由特定的甲基轉(zhuǎn)移酶特異性識別tRNA鳥嘌呤(G)第一位N原子，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine，AdoMet/ SAM)為甲基供體，在識別位點添加一個甲基基團(tuán)而形成(圖1-A)。目前已經(jīng)在古菌、細(xì)菌和真核生物中鑒定到m1G修飾，存在于不同tRNA的第9位或第37位(圖1-B)。

A：G在m1G甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下形成m1G；B：tRNA第9位和37位G可以甲基化形成m1G

研究表明人類線粒體tRNA的結(jié)構(gòu)缺陷與m1G9修飾功能的缺失有關(guān)，源于TRMT10A基因突變或失活[11]。TRMT10A是負(fù)責(zé)人類tRNA中m1G9修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，TRMT10A的缺陷可導(dǎo)致智力障礙、小頭畸形和青春期延遲[11]。

相對第9位的m1G修飾來說，tRNA第37位的m1G修飾有助于密碼子的準(zhǔn)確識別[12-13]。缺乏m1G37修飾會導(dǎo)致tRNA在翻譯過程中可能發(fā)生移碼突變，最終導(dǎo)致讀碼框的紊亂[14]。

2 在tRNA中負(fù)責(zé)m1G修飾的酶

負(fù)責(zé)tRNA上m1G9和m1G37修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶屬于SPOUT甲基轉(zhuǎn)移酶家族或RFM甲基轉(zhuǎn)移酶家族，它們均以AdoMet為甲基供體。

自然界中普遍存在SPOUT甲基轉(zhuǎn)移酶，催化形式多種多樣，但所有的SPOUT甲基轉(zhuǎn)移酶都具有一個共同的核心結(jié)構(gòu)域——“SPOUT”結(jié)構(gòu)域。迄今發(fā)現(xiàn)的所有Trm10蛋白在SPOUT結(jié)構(gòu)域中的氨基酸序列具有整體相似性[15-16]。SPOUT結(jié)構(gòu)域的折疊方式分為Ⅰ型和Ⅱ型(圖2)，這兩種折疊方式都有著一個類似三葉結(jié)(trefoil)的結(jié)構(gòu)。SPOUT結(jié)構(gòu)域的三葉結(jié)結(jié)構(gòu)為甲基供體AdoMet提供了結(jié)合位點，從而將活化后的甲基轉(zhuǎn)移到底物RNA上，產(chǎn)生甲基化的RNA和S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosine-homocysteine，AdoHcy/SAH)[5]。

圖 2 SPOUT甲基轉(zhuǎn)移酶的蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)Figure 2 Protein domain topology of the SPOUT MTases

RFM甲基轉(zhuǎn)移酶家族包含RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和大部分的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶[4]。RFM折疊由7個β折疊和分布在β折疊兩側(cè)的6個α螺旋構(gòu)成(圖3)。RFM甲基轉(zhuǎn)移酶有單聚體、二聚體、三聚體和四聚體模式，但最常見的是單聚體。大多數(shù)RFM甲基轉(zhuǎn)移酶在RFM折疊結(jié)構(gòu)域外包含一個輔助域，這些輔助域整體插入RFM折疊結(jié)構(gòu)中，并在識別底物過程中發(fā)揮重要作用[4]。

圖 3 RFM甲基轉(zhuǎn)移酶的蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)Figure 3 Protein domain topology of the RFM MTases

tRNA-m1G9修飾存在于真核生物和古細(xì)菌中，在細(xì)菌中還沒有發(fā)現(xiàn)tRNA-m1G9修飾的存在[1]。酵母中負(fù)責(zé)tRNA-m1G9修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶是Trm10p，其同源蛋白在真核生物和古細(xì)菌中廣泛存在[17]。多細(xì)胞動物可以同時存在多個Trm10的同源酶，例如人類細(xì)胞中Trm10的3個同源蛋白TRMT10A、TRMT10B和TRMT10C。

細(xì)菌中負(fù)責(zé)tRNA-m1G37修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶是TrmD，屬于SPOUT甲基轉(zhuǎn)移酶家族；真核生物和古生菌中負(fù)責(zé)tRNA-m1G37修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶是Trm5，屬于RFM甲基轉(zhuǎn)移酶家族[18]。下面分別對不同物種中鑒定到的m1G甲基轉(zhuǎn)移酶及其特性進(jìn)行詳細(xì)介紹。

2.1 m1G9

如上文所述，負(fù)責(zé)tRNA-m1G9修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶——Trm10酶家族，屬于SPOUT甲基轉(zhuǎn)移酶。蛋白晶體結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，Trm10酶家族由一個非保守的N端結(jié)構(gòu)域，一個SPOUT催化結(jié)構(gòu)域(Ⅱ類亞型)和一個非保守的C端結(jié)構(gòu)域組成。大多數(shù)SPOUT家族成員為二聚體蛋白，但是所有的Trm10類同源蛋白的晶體結(jié)構(gòu)都是單聚體[1,19]。雖然蛋白聚合狀態(tài)不同，但是SPOUT催化結(jié)構(gòu)域本身結(jié)構(gòu)相差無幾，有著非常相似的AdoMet結(jié)合位點。在二聚體SPOUT蛋白對嘌呤進(jìn)行修飾時，兩個亞基中的SPOUT催化域會同時起催化作用，完成甲基化反應(yīng)[20]。除SPOUT催化域外，許多SPOUT蛋白的N端或C端結(jié)構(gòu)域?qū)RNA的結(jié)合也起到一定的協(xié)助作用[19-23]。嗜酸熱硫化葉菌Trm10(SaTrm10)和tRNAMet的嵌合模型表明，SaTrm10的N端結(jié)構(gòu)域和tRNA接受臂相互作用，而C端結(jié)構(gòu)域參與tRNA的結(jié)構(gòu)重塑，使原本位于tRNA內(nèi)部的第9位腺苷浮出表面，便于甲基化反應(yīng)的進(jìn)行[19,24]。但遺憾的是，目前還沒有研究獲得Trm10蛋白和tRNA結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)。

真核生物中的m1G9修飾存在于細(xì)胞質(zhì)tRNA和線粒體tRNA中。在酵母基因組中，tRNA-m1G9修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶Trm10p定位于細(xì)胞質(zhì)，Trm10p的缺失對酵母的生存能力沒有明顯影響，但造成其對5氟尿嘧啶(5FU)敏感，在5FU存在情況下生長嚴(yán)重受阻[17,25]。

人類基因組含有3個Trm10同源蛋白——TRMT10A、TRMT10B和TRMT10C，他們分別定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。研究表明：TRMT10A在人類胚胎和胎兒大腦中均有表達(dá)，基因突變會導(dǎo)致小頭癥，身材矮小和嚴(yán)重的糖尿??；抑制TRMT10A基因的表達(dá)不會損害分泌胰島素的β細(xì)胞的功能，但是會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對大腦神經(jīng)元產(chǎn)生負(fù)面影響，造成一系列病癥的出現(xiàn)[11]。對酵母的異源互補(bǔ)實驗說明人類TRMT10A和TRMT10B蛋白具有不同的生物學(xué)功能[26]。同時，蛋白體外活性研究表明，TRMT10B與其他Trm10同源蛋白相比，催化tRNA-m1G9的效率較低，但可以同時催化tRNAAsp上m1A9的形成[26]。

TRMT10C和HSD10(一種線粒體代謝酶)形成復(fù)合物后才能作為甲基轉(zhuǎn)移酶起作用[27-29]。研究表明，m1G9的形成依賴于TRMT10C活性部位的天冬氨酸殘基314(D314)和非活性位點的谷氨酰胺殘基226(Q226)[30]。

2.2 m1G37

細(xì)菌中負(fù)責(zé)tRNA-m1G37修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶是TrmD，屬于SPOUT蛋白家族。在遺傳信息解碼過程中，m1G37修飾位于反密碼子的3′端，對于抑制移碼錯誤起至關(guān)重要的作用[31-32 ]。TrmD是一個同型二聚體，每個單體由3個結(jié)構(gòu)域組成：一個N端結(jié)構(gòu)(NTD，即SPOUT結(jié)構(gòu)域)，負(fù)責(zé)結(jié)合甲基供體AdoMet；一個C端結(jié)構(gòu)域(CTD)，負(fù)責(zé)與底物tRNA的結(jié)合；以及一個中間鏈接器[33-34]。在TrmD-tRNAGlnCUG-sinefungin(簡稱sfg，AdoMet的類似物)形成的晶體結(jié)構(gòu)中，TrmD二聚體的兩個亞基A和B分別與sfg結(jié)合，但只有B亞基可以把tRNA-G37定位在中間鏈接器中，繼而發(fā)生甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)[20](圖4-A)。甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)開始前，TrmD B亞基中的天冬氨酸169(D169)從G37 1-NH上接受一個質(zhì)子，使G37形成脫質(zhì)子中間態(tài)，這種中間態(tài)極不穩(wěn)定，而TrmD B亞基中的精氨酸154(R154)位于tRNA-G37和sfg之間，可以穩(wěn)定這種中間態(tài)，為后續(xù)甲基轉(zhuǎn)移做準(zhǔn)備[35]。TrmD B亞基與底物tRNA結(jié)合時，會先與tRNA-G36相互作用，TrmD B亞基與tRNA-G36的結(jié)合可以增強(qiáng)TrmD對tRNA-G37的特異性識別，增強(qiáng)結(jié)合之后的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[20,36]。隨后G37堿基的一部分從反密碼子環(huán)中翻轉(zhuǎn)出來，插入到TrmD B亞基的N端催化域中，催化域中的天冬氨酸169、精氨酸154側(cè)鏈與tRNA-G37的1-NH和2-NH2基團(tuán)結(jié)合，從而實現(xiàn)對tRNA-G37的特異性識別[34]。同時，sfg與B亞基NTD結(jié)構(gòu)域中的三葉結(jié)深裂縫結(jié)合，形成彎曲形狀，只有這種彎曲形狀的甲基供體才能實現(xiàn)向tRNA 37位鳥嘌呤的甲基轉(zhuǎn)移[35](圖4-B)。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn) TrmD在甲基化tRNA-G37的過程中還需要Mg2+的參與，Mg2+可以促進(jìn)甲基轉(zhuǎn)移過程中G37脫質(zhì)子中間態(tài)的形成，同時也作為G37的直接配體起作用[37]。

A：整體結(jié)構(gòu)；B：催化中心

A：整體結(jié)構(gòu)；B：催化中心；C：反密碼子環(huán)

真核生物和古菌中負(fù)責(zé)tRNA-m1G37的甲基轉(zhuǎn)移酶是Trm5，屬于RFM蛋白家族。Trm5以單體形式存在，晶體結(jié)構(gòu)由結(jié)構(gòu)域1(D1)、結(jié)構(gòu)域2(D2)和結(jié)構(gòu)域3(D3)組成[38]。其中D1保守度較低，D2高度保守，D3為RFM結(jié)構(gòu)域，是催化結(jié)構(gòu)域。詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)MjTrm5-tRNAGlyGCA-AdoMet嵌合模型顯示，D2和D3結(jié)構(gòu)域tRNA反密碼子環(huán)相互作用，其中tRNA的D環(huán)和T環(huán)夾在Trm5的D2和D3之間，而D1則與tRNA的L型外角相互作用(圖5-A)[36]。tRNA的L型外角與D1結(jié)構(gòu)域的相互作用可以增強(qiáng)tRNA在高溫下的親和力，對于高溫環(huán)境下生存的詹氏甲烷球菌具有重要意義[18]。Trm5的D2～D3結(jié)構(gòu)域包含了特異性識別tRNA-G37所需要的所有元素[18]。甲基化過程中，tRNA中的G37被翻轉(zhuǎn)到D2和D3形成的催化域中，Trm5精氨酸145(R145)和天冬酰胺265(N265)的側(cè)鏈可以特異性識別鳥苷，同時G37的N1位原子被固定到AdoMet的旁邊，便于甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)進(jìn)行(圖 5-B)。此外，底物tRNA反密碼子臂上38-41位的磷酸基和D莖上24-26位的磷酸基形成的結(jié)合框架與Trm5的D2和D3相互作用；tRNA C32和A38的堿基相對，并與Trm5脯氨酸322(P322)堆疊在一起，可能是促成G37從tRNA內(nèi)部翻轉(zhuǎn)到外部的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[18](圖5-C)。

3 結(jié)論與展望

本文總結(jié)了目前已知參與tRNA第9位和37位2種m1G修飾合成的蛋白分類，比較了合成這兩個位點的甲基轉(zhuǎn)移酶的不同結(jié)構(gòu)和生化特性，從酶和底物tRNA特異性結(jié)合的分子基礎(chǔ)，揭示隸屬SPOUT和RFM不同家族的甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)tRNA上不同位點的m1G形成的分子機(jī)制。

tRNA的正確修飾可以確保tRNA的折疊和有效的翻譯過程，還可以使tRNA適應(yīng)不同的細(xì)胞生長環(huán)境。由于基因突變導(dǎo)致的tRNA甲基化異常還與人類疾病息息相關(guān)，RNA上的甲基化修飾及相關(guān)修飾蛋白的功能研究已成為了研究熱點之一。隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步和更多物種中RNA上甲基化修飾位點的鑒定，我們對tRNA甲基化修飾的功能也有了新的認(rèn)知。但是相對動物而言，植物中的研究尚屬初步，仍然存在許多未解之謎。

本實驗室致力于高等植物中tRNA核苷修飾的功能研究，并取得了重要研究成果[38]。結(jié)合m1G37甲基化修飾的研究成果，我們將以擬南芥和水稻為研究材料，結(jié)合遺傳、蛋白體外生化和植物生理學(xué)等研究方法，深入研究m1G9修飾對高等植物生長發(fā)育，特別是逆境耐受的影響，希望通過這些研究揭示tRNA-m1G甲基化修飾及其相關(guān)蛋白在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞代謝途徑的影響，為作物tRNA核苷修飾的研究奠定基礎(chǔ)。