王 慧， 尚政軍

（湖北省口腔基礎醫(yī)學重點實驗室·省部共建國家重點實驗室培育基地，武漢大學口腔生物醫(yī)學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430072）

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）是口腔頜面部最常見的一類惡性腫瘤[1]。 2018 年， 口腔癌新增病例約35.4 萬例，其中90%的口腔癌是OSCC[2]。 由于預后不良，OSCC 致死率較高[3]。 因此，需要在現(xiàn)有治療水平的基礎上進一步尋找新的治療方法。

低氧誘導因子-1α（HIF-1α）最早由Semenza 等[4]發(fā)現(xiàn)，是一種對氧敏感的轉(zhuǎn)錄激活因子。 大多數(shù)實體瘤組織內(nèi)都存在缺氧現(xiàn)象，細胞和組織對缺氧的適應導致一系列基因的轉(zhuǎn)錄誘導。 介導這種適應性反應的主要因子是HIF-1α[4]。 當局部組織缺氧狀態(tài)持續(xù)存在時， 細胞內(nèi)HIF-1α 的表達量就會增加，從而導致下游一系列靶基因表達發(fā)生生物效應變化[5]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類單鏈小分子非編碼RNA， 約含22 nt。 它們通過與靶點信使RNA(mRNA)的3′-UTR 進行堿基互補配對，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達方面發(fā)揮重要作用[6]。 自miRNA被發(fā)現(xiàn)以來， 大量文獻報道了多種miRNA 在不同腫瘤中異常表達， 揭示了其與腫瘤之間關系密切[7]。腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程十分復雜，其中涉及大量基因的表達變化和分子表達水平的改變。 在OSCC 進展過程中，僅僅在遷移、增殖方面就有多種miRNA在其中擔任不同角色。 更有腫瘤細胞干性、腫瘤細胞促血管生成等方面的研究提示， 大量miRNA 參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。這些研究提示，miRNA 在未來可以作為治療靶點研發(fā)新藥物。MiR-210-3p 與多種疾病發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系，可作為一些疾病的生物標志物， 也參與了腫瘤的遷移、 增殖、分化、凋亡等過程[8-9]。 因與HIF-1α 之間的相互作用，使miR-210-3p 成為機體重要的缺氧調(diào)控因子[10]。 目前，兩者之間的協(xié)調(diào)作用以及miR-210-3p 在OSCC中的生物效應尚未有相關研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

胎牛血清（Gibco 公司，美國），DMEM 高糖培養(yǎng)基（HyClone 公司，美國），miR-210-3p 模擬物和miR-210-3p抑制物（上海吉瑪制藥技術有限公司，中國），RIPA裂解液（Beyotime 公司，中國），HIF-1α、β-actin 抗體（武漢三鷹生物技術有限公司， 中國），Highgene 轉(zhuǎn)染試劑（Abclonal 公司，中國），CCK-8 試劑盒（同仁公司，日本）。

1.2 細胞培養(yǎng)

人OSCC 細胞系（CAL-27）購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。 將CAL-27 細胞置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。低氧培養(yǎng)條件為37 ℃、94%N2、5%CO2、1%O2。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應

將細胞置于6 孔板中培養(yǎng)后丟棄培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）洗2 遍后于每孔中各加入1 mL TRIzol 試劑， 反復吹打后轉(zhuǎn)移至無酶EP 管。 每管加入200 μL 三氯甲烷溶液，充分振蕩后離心，取上清液加入500 μL 異丙醇，混勻后離心。 將離心后得到的RNA 進行沉淀，DEPC（diethyl pyrocarbonate）水配制的75%的乙醇洗滌2 次后用適量65 ℃的DEPC 水溶解。測量RNA 濃度后，使用生工miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加尾法）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，設計miR-210-3p 特異性上游引物，并以U6為內(nèi)參進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription PCR, RT-PCR） 檢測。 所用引物序列為：MiR-210-3p 上 游 引 物，5′-CTGTGCGTGTGACAGC-GG-3′；U6 上游引物，5′-ATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3′。 下游引物由生工生物miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加尾法）提供。

1.4 Western 印跡法

在處理后的細胞中加入100~150 μL 含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液，冰浴裂解，離心后取上清液，采用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測定蛋白濃度。 加入20%體積的蛋白上樣緩沖液。 使用12.5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate, SDS）-聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE） 進行電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，使用5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗于4 ℃下孵育過夜。 TBST 緩沖液洗膜，二抗孵育1 h，再次洗膜后孵育于發(fā)光液中，并通過發(fā)光儀器進行檢測。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

細胞接種并貼壁后， 根據(jù)說明書提示使用Highgene 轉(zhuǎn)染試劑將miR-210-3p 模擬物和miR-210-3p 抑制物及其相應的陰性對照（NC）轉(zhuǎn)染至細胞中， 得到miR-210-3p 模擬物組、miR-210-3p 模擬物-NC 組、miR-210-3p 抑制物組及miR-210-3p 抑制物-NC 組。 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，RT-PCR 檢測其轉(zhuǎn)染效率。

1.6 CCK-8 法檢測細胞增殖

將分組處理過的細胞以5 000 個/孔的密度接種于96 孔板中， 分別培養(yǎng)24、36、48 h 后， 按照CCK-8 試劑盒說明書提示，加入CCK-8 試劑培養(yǎng)2 h，使用酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度值。

1.7 劃痕實驗

接種細胞至6 孔板中， 待細胞生長至80%～90%后用1 mL 無菌移液槍頭垂直孔板底劃3 條直線，相鄰直線間距0.5 cm，確保每條直線寬度一致。PBS 洗去漂浮細胞后加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、3、6、12 h 時顯微鏡下觀測并拍照記錄。 使用Image J 軟件測量細胞遷移距離。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 分析， 樣本間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 時表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧誘導CAL-27 細胞內(nèi)HIF-1ɑ 及miR-210-3p 表達水平升高

將CAL-27 細胞置于低氧培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)12、24、48 h 后， 提取處理過的細胞及正常條件培養(yǎng)的CAL-27 細胞總蛋白和總RNA，用Western 印跡法檢測細胞內(nèi)HIF-1ɑ 的表達量。 結(jié)果顯示，低氧條件下（1% O2）培養(yǎng)48 h 后，細胞內(nèi)HIF-1ɑ 表達量明顯升高（圖1A）。

RT-PCR 檢測上述細胞內(nèi)miR-210-3p 的表達量，發(fā)現(xiàn)低氧條件培養(yǎng)24 h 和48 h 后，細胞內(nèi)miR-210-3p 表達量均顯著升高，并呈逐漸增加的趨勢（圖1B）。

2.2 HIF-1ɑ 促使CAL-27 細胞內(nèi)miR-210-3p 表達水平上升

在CAL-27 培養(yǎng)基中加入人工合成的HIF-1ɑ，常氧條件下（20%O2）培養(yǎng)24 h 后，提取細胞總RNA，RT-PCR 檢測細胞中miR-210-3p 的表達量。 結(jié)果顯示，HIF-1ɑ 刺激細胞后，細胞內(nèi)miR-210-3p 表達量升高（圖2）。

2.3 CAL-27 細胞內(nèi)miR-210-3p 水平的變化導致細胞遷移能力的改變

將miR-210-3p 模擬物和miR-210-3p 抑制物及其相應的NC 組轉(zhuǎn)染至細胞中，轉(zhuǎn)染24 h 后提取細胞總RNA，檢測轉(zhuǎn)染效率。 RT-PCR 結(jié)果顯示，相比各自的NC 組，miR-210-3p 模擬物組轉(zhuǎn)染24 h 后，CAL-27 細胞內(nèi)miR-210-3p 表達量顯著上升（圖3A）；轉(zhuǎn)染miR-210-3p 抑制物的細胞內(nèi)miR-210-3p 表達量下降（圖3A）。

圖1 低氧誘導后CAL-27 細胞內(nèi)HIF-1ɑ 與miR-210-3p 的水平變化Figure 1 Changes of HIF-1ɑ and miR-210-3p levels in CAL-27 cells after hypoxia induction

圖2 經(jīng)HIF-1ɑ 刺激后的CAL-27 細胞內(nèi)miR-210-3p 的表達水平Figure 2 Expression level of miR-210-3p in CAL-27 cells after HIF-1ɑ stimulation

轉(zhuǎn)染后的細胞用劃痕實驗檢測其遷移能力是否發(fā)生了改變。 結(jié)果顯示，相同時間內(nèi)相比各自的NC 組， 轉(zhuǎn)染miR-210-3p 模擬物的CAL-27 細胞遷移能力提升（圖3B、圖4A～4F）；而轉(zhuǎn)染miR-210-3p抑制物的細胞遷移能力下降（圖3B、圖4G～4L）。

2.4 CAL-27 細胞內(nèi)miR-210-3p 水平的變化導致細胞增殖能力的改變

用CCK-8 實驗檢測上述轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力的改變。 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24、48、72 h 后，相比對照組，miR-210-3p 模擬物可以促進CAL-27 細胞增殖（圖5A）；miR-210-3p 抑制物降低細胞內(nèi)miR-210-3p 表達量后，CAL-27 細胞的增殖能力則受到顯著抑制（圖5B）。

圖3 不同處理組CAL-27 細胞內(nèi)miR-210-3p 的水平及細胞遷移能力的改變Figure 3 Changes in miR-210-3p level and cell migration ability in CAL-27 cells of different treatment groups

圖4 細胞遷移實驗（×100）Figure 4 Cell migration experiment（×100）

圖5 CAL-27 細胞內(nèi)miR-210-3p 水平的變化后細胞增殖能力的改變Figure 5 Changes in cell proliferation ability after changes in miR-210-3p levels in CAL-27 cells

3 討論

雖然近年來關于腫瘤各個方面的研究越來越多，但大多數(shù)癌癥發(fā)生、發(fā)展的具體分子機制和致病機制至今尚不明確。OSCC 生長速度較快，其生長時需大量供氧。 因此，腫瘤組織的生長必然伴隨著缺氧環(huán)境的形成。HIF-1ɑ 是腫瘤組織在低氧狀態(tài)下調(diào)節(jié)自身適應環(huán)境的關鍵因子[6-7,11-12]。

MiR-210-3p 在多種腫瘤組織及患者血清中存在異常表達，提示miR-210-3p 可能在腫瘤發(fā)生或發(fā)展過程中起一定作用。因miR-210-3p 在肺腺癌組織中的高表達使其可能成為預測及診斷肺腺癌的標志物； 在非小細胞肺癌患者中，miR-210-3p 高表達者比低表達者的無瘤生存率低，預后更差[13]；卵巢癌患者血清中miR-210-3p 表達增高，且其表達水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、 國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期、分化程度及組織類型相關[14]。 已有研究表明，miR-210-3p 與OSCC 也相關， 與正?？谇簧掀そM織相比，OSCC 組織中miR-210-3p 表達量更多[15-16]。 但有關miR-210-3p 在OSCC 發(fā)生、發(fā)展中扮演角色的研究,至今尚無報道。

有學者從對圍繞HIF-1ɑ 的低氧相關通路的研究中發(fā)現(xiàn)，與HIF-1ɑ 關系最密切的miRNA 是miR-210-3p[10]。 據(jù)已有研究證明， HIF-1ɑ 與miR-210-3p之間存在正反饋通路， 兩者相互作用抑制對方降解，從而實現(xiàn)濃度積累[17-18]。 而沉默HIF-1ɑ 后，低氧條件不能導致施萬細胞內(nèi)miR-210-3p 的積累[19]。

實驗證實，低氧狀態(tài)下，OSCC 細胞中表達了更多的HIF-1ɑ， 而增多了的HIF-1ɑ 導致細胞內(nèi)miR-210-3p 表達量升高。我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-210-3p 可以促進CAL-27 細胞增殖和遷移， 而下調(diào)miR-210-3p則導致CAL-27 細胞增殖和遷移能力下降?？赏茢?，OSCC 組織內(nèi)持續(xù)存在的低氧狀態(tài)必然導致HIF-1ɑ水平升高， 而HIF-1ɑ 帶來了一系列應對缺氧環(huán)境的改變，其中一個就是通過上調(diào)miR-210-3p 的表達量來促進腫瘤生長及進展。MiR-210-3p 可以作為研究OSCC 治療方法的新靶點。