孟珊珊，譚明，肖冬光，宋詼*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津，300308)

植物甜蛋白是指自然界中存在有甜味或可以引起甜味產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，它們大多具有高倍甜度、低熱量且安全無毒的特點，作為蔗糖替代品，不會引起高血壓、高血脂、糖尿病等疾病，在食品和制藥等行業(yè)有著潛在的應(yīng)用價值[1-2]。迄今為止，學(xué)者從植物中已分離出7種甜蛋白，包括索馬甜(Thaumatin)、馬檳榔(Mabinlin)、巴西甜蛋白(Brazzein)、莫奈林(Monellin)、奇異果(Miraculin)、培它汀(Pentadin)及仙茅甜蛋白(Curculin)[3-4]。其中Brazzein由于具有良好的溶解性，較好的pH和熱穩(wěn)定性，是一種具有應(yīng)用潛力的天然來源的高倍甜味劑[5]。

Brazzein由MING等[6]1994年在非洲西部野生植物PentadiplandrabrazzeanaBaillon果實中首次分離發(fā)現(xiàn)。該蛋白分子由54個氨基酸殘基組成，活性形式為單體，蛋白分子質(zhì)量為6.5 kDa[7]。分子二級結(jié)構(gòu)包含1個短α-螺旋(殘基21～29)和3個反平行β-折疊(鏈I，殘基5～7；鏈II，殘基44～50；鏈III，殘基34～39)[8-9]。其分子內(nèi)部還包含4個二硫鍵(Cys4-Cys52、Cys16-Cys37、Cys22-Cys47和Cys26-Cys49)，是其具有良好穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

除了在高倍甜味劑方面的應(yīng)用外，有研究表明，巴西甜蛋白具有一定的消炎和抗氧化性，且其蛋白序列與抗細菌多肽防御素和胰蛋白酶抑制劑有42%～45%的相似性，與抗菌蛋白1(antimicrobial protein 1)、德羅霉素(drosomycin)、蝎子毒素(scorpion alpha-toxin OD1)、神經(jīng)毒素(neurotoxin)和植物防御素(plant defensin)等都具有高度相似性[10]。有研究表明，其對于部分細菌和真菌具有一定的抑菌活性[11]。

由于巴西甜蛋白來源于植物，直接提取工藝復(fù)雜且產(chǎn)量低，不能滿足市場需求[12]，通過基因工程的手段高效表達外源巴西甜蛋白，并對其性能進行研究和應(yīng)用開發(fā)均具有重要意義。目前已經(jīng)有研究者將Brazzein基因構(gòu)建到大腸桿菌表達系統(tǒng)[13]，但是經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，表達的巴西甜蛋白以包涵體的形式存在[14-15]，純化后的重組甜蛋白還需要進一步的復(fù)性才具有活性[16]。

本研究選用畢赤酵母表達系統(tǒng)對巴西甜蛋白與蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)進行外源共表達；利用超濾-納濾膜分離系統(tǒng)和冷凍干燥技術(shù)開發(fā)重組Brazzein的低成本制備工藝；對重組Brazzein進行口感評價，并研究其對常見致病菌和腸道益生菌的體外抑菌性能，為其在甜味劑方面的推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α、畢赤酵母(Pichiapastoris) GS115、枯草芽孢桿菌ATCC6633、金黃色葡萄球菌ATCC27217、大腸桿菌ATCC25922、白念珠菌ATCC36082、檜狀靑霉ATCC10519、干酪乳桿菌ATCC334、嗜酸乳桿菌ATCC4356、糞腸球菌ATCC29212及質(zhì)粒pPIC9K、pPICZA-PDI,均為天津工業(yè)生物技術(shù)研究所工業(yè)酶工程研究組實驗室保存。

1.2 主要試劑與材料

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶,NEB公司；高保真DNA聚合酶、MIX酶,康為世紀公司;質(zhì)粒小提試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒等,TIANGEN公司;無氨基酵母氮源(YNB)培養(yǎng)基、葡萄糖,Solarbio公司;生物素，生物基礎(chǔ)公司；無水甲醇,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;PCR所需引物，北京擎科有限公司合成;超納濾膜芯,杭州瑞納膜工程有限公司。

2 實驗方法

2.1 Brazzein和PDI共表達質(zhì)粒的構(gòu)建

按照畢赤酵母密碼子偏好性合成Brazzein 基因(KF013250.1)，并克隆到穿梭質(zhì)粒pPIC9K多克隆位點EcoR I和NotI之間，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pPIC9K-Brazzein。將重組表達質(zhì)粒pPIC9K-Brazzein以及空白質(zhì)粒pPIC9K分別用SacI酶切線性化，電轉(zhuǎn)(1 500 V)到畢赤酵母GS115感受態(tài)，用1 mol/L山梨醇緩沖液重懸細胞，然后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布MD平板。將重組質(zhì)粒pPICZA-PDI用SacI單酶切線性化，然后電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115(pPIC9K-Brazzein)感受態(tài)中，用1 mol/L山梨醇緩沖液重懸保護，涂布Zeocin平板。

2.2 重組畢赤酵母工程菌GS115 pPIC9K-Brazzein的誘導(dǎo)表達

將畢赤酵母重組工程菌株GS115(pPIC9K-Brazzein)劃線于YPD平板，挑取重組畢赤酵母工程菌單克隆接種到10 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)36 h左右，OD600達到3左右。然后收集菌體轉(zhuǎn)接到20 mL BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并加400 μL無水甲醇進行誘導(dǎo)表達。每隔24 h添加體積分數(shù)為2%的無水甲醇，取2 mL誘導(dǎo)菌液離心并保留上清液，用于后續(xù)分析畢赤酵母表達重組Brazzein的水平。

2.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)

取畢赤酵母誘導(dǎo)表達發(fā)酵上清液1 mL，用三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液沉淀蛋白，得到的蛋白樣品加入20 μL 6 mol/L的脲素溶解，并加入5 μL 5×蛋白電泳上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸10 min。樣品冷卻后取10 μL蛋白樣品、5 μL蛋白Marker開始上樣，并采用90～120 V電泳。

2.4 重組Brazzein的發(fā)酵小試

挑取GS115(pPIC9K-Brazzein)單菌落接種于400 mL YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600=10左右；將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基BSM(體積分數(shù)4%甘油、BSM基礎(chǔ)鹽類、PTM1鹽類)中30 ℃培養(yǎng)，通氣量400 L/h、初始轉(zhuǎn)速為400 r/min，設(shè)定溶氧為20%，并設(shè)置溶氧與轉(zhuǎn)速聯(lián)動。當溶氧(dissolved oxygen,DO)<20%，轉(zhuǎn)速逐步提高以控制DO值為20%，最大轉(zhuǎn)速為800 r/min，用體積分數(shù)28%的NH3·H2O調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為5.0左右。發(fā)酵21 h左右，甘油消耗殆盡，當DO升高,轉(zhuǎn)速降低時,每升加入含12 mL PTM1的甘油進行補料。補料至濕菌體質(zhì)量達到180～220 g/L后停止；待甘油完全耗盡后饑餓1 h，DO上升后進行甲醇補料培養(yǎng)。

2.5 表達產(chǎn)物的初步膜法分離純化

重組菌誘導(dǎo)到最佳時間后，離心收集菌體發(fā)酵上清液，利用瑞納小型1812超濾-納濾膜過濾系統(tǒng)進行純化過濾。膜芯先選用星達Synder1812V0.1/1 000 kDa進行預(yù)過濾除菌體，然后采用星達Synder1812MK/30 kDa進行超濾除雜質(zhì)，最后采用星達Synder1812XT/1 kDa、星達Synder1812NFG/600 Da或星達Synder1812VT/3 kDa分別在3種壓力(0.2、0.4、0.6 MPa)下進行納濾，回收可溶性重組甜蛋白，過濾溫度為20 ℃。加入2倍體積純水對納濾體系進行清洗后，獲得重組甜蛋白濃縮液。采用凍干的方式進行干燥濃縮，稱量得到的粉末，密封保存在-20 ℃，用于后續(xù)Brazzein的活性檢測。

2.6 重組Brazzein的甜味檢測

雙盲感官評定：將甜蛋白樣品加蒸餾水稀釋100倍，配制成質(zhì)量濃度為10 g/L的母液，再梯度稀釋為質(zhì)量濃度1、0.5、0.25、0.125 g/L的溶液，用20 g/L的蔗糖作為對照，秘密編號(A:1 g/L蛋白、B:0.5 g/L蛋白、C:0.25 g/L蛋白、D:0.125 g/L蛋白、E:20 g/L蔗糖)，選取9名志愿者組成口感評價小組，亂序品嘗上清液，每人單獨描述對品嘗樣品和蔗糖的甜度進行排序打分，并記錄數(shù)據(jù)。確定與20 g/L的蔗糖甜度相當?shù)臉悠窛舛?，從而計算出目的甜蛋白的甜度?/p>

2.7 重組Brazzein的抑菌實驗

利用制備出的重組Brazzein配制待測水溶液，質(zhì)量濃度為30 mg/mL，進行抑菌試驗。指示菌分別為：枯草芽孢桿菌ATCC6633、金黃色葡萄球菌ATCC27217、大腸桿菌ATCC25922、白念珠菌ATCC36082、檜狀靑霉ATCC10519、干酪乳桿菌ATCC334、嗜酸乳桿菌ATCC4356、糞腸球菌ATCC29212。最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)值測定采用試管二倍稀釋法，向滅菌試管中加入各自培養(yǎng)基(pH 7.5)1 mL，依次編號，在第1管中加入濃縮樣品1 mL，混勻后吸取1 mL至第2管，依次類推至第9管，棄去最后吸取的1 mL，然后于每管中加入0.1 mL濃度稀釋至1×108CFU/mL菌液，第10管加入菌液不含巴西甜蛋白作為陽性對照，第11管只加營養(yǎng)肉湯作為陰性對照，分別依次測定MIC值。

3 結(jié)果與分析

3.1 pPIC9K-Brazzein表達質(zhì)粒的構(gòu)建

如圖1所示，優(yōu)化后的基因連接到pPIC9K載體的EcoR I和NotI酶切位點，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-Brazzein。

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of recombinant plasmid construction

3.2 重組畢赤酵母GS115基因組的PCR鑒定

利用AOX引物PCR驗證pPIC9K-Brazzein整合畢赤酵母基因組情況，篩選Mut+整合，可見2條帶，1條與目的基因相關(guān)，大小為Brazzein基因片段大小加492 bp，另1條為AOX1基因(大約為2.2 kb)。如圖2所示，條帶大小分別為2.2 kb和660 bp，測序結(jié)果顯示正確轉(zhuǎn)化，Brazzein基因被成功整合到畢赤酵母GS115基因組上。

M-核酸分子標記物；1、2-GS115(pPIC9K-Brazzein)轉(zhuǎn)化子；--陰性對照；+-陽性對照圖2 酵母轉(zhuǎn)化子的PCR驗證Fig.2 Yeast transformant PCR verification

利用Text引物PCR驗證pPICZA-PDI整合畢赤酵母基因組情況，篩選正確的陽性轉(zhuǎn)化子，如圖3所示。陽性轉(zhuǎn)化子在瓊脂糖凝膠電泳中可見1條帶，大小即為PDI的大小1 554 bp。測序結(jié)果顯示正確轉(zhuǎn)化，PDI基因被成功整合到畢赤酵母GS115基因組上。最終成功構(gòu)建了重組菌株GS115(pPIC9K- Brazzein，pPICZA-PDI)。

M-核酸分子標記物；1、2、3、4-GS115(pPIC9K-Brazzein，pPICZA-PDI)轉(zhuǎn)化子圖3 重組共表達菌株轉(zhuǎn)化子PCR驗證Fig.3 PCR validation of recombinant co-expressing strainstransformants

3.3 重組Brazzein的表達

如圖4所示，在6.5 kDa處重組子有1條明顯的蛋白條帶，和理論分子質(zhì)量大小一致，而對照沒有此條帶。用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測重組Brazzein質(zhì)量濃度，表達量達到1 g/L。

M-蛋白分子標記物；1-GS115(pPIC9K-Brazzein,pPICZA-PDI)；2-GS115(pPIC9K,pPICZA-PDI)圖4 重組Brazzein表達電泳圖Fig.4 SDS-PAGE for the expression of recombinant Brazzein

3.4 5 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)和超濾納濾膜法分離

發(fā)酵過程分為3個階段：甘油批式發(fā)酵、甘油補料培養(yǎng)和甲醇補料培養(yǎng)。甘油批式發(fā)酵至22.95 h時，甘油消耗殆盡，發(fā)酵罐中DO值迅速上升，達到41%，細胞濕質(zhì)量達到107.2 g，此時開始進入第2階段，甘油補料培養(yǎng)，增加細胞量。在培養(yǎng)至32.02 h時停止甘油補料培養(yǎng)，進入第3階段，甲醇補料培養(yǎng)。在發(fā)酵至142.61 h時，菌體生長趨于穩(wěn)定，每升發(fā)酵液中細胞濕質(zhì)量達到301 g，畢赤酵母表達Brazzein發(fā)酵曲線如圖5所示。利用超濾-納濾膜過濾系統(tǒng)對發(fā)酵上清液進行純化過濾，對比不同壓力下SynderVT/3 kDa、SynderXT/1 kDa和SynderNFG/600 Da對于重組Brazzein的回收率，結(jié)果如圖6所示。使用SynderNFG/600 Da在0.6 MPa工作壓力下的回收效率最高，可達70.8%。

圖5 畢赤酵母表達Brazzein誘導(dǎo)發(fā)酵曲線Fig.5 Fermentation curve of Pichia pastoris expressionBrazzein

3.5 重組Brazzein的甜味檢測

隨機提供給評價員A、B、C、D、E五種樣品，經(jīng)過多次品嘗，通過對重組Brazzein和蔗糖的雙盲感官檢驗，采用排序法，并按甜度高低進行排序，給出每個樣品的秩次，統(tǒng)計每個樣品的秩和，采用弗里德曼(Friedman)檢驗分析，結(jié)果如表1所示。

圖6 三種納濾膜在不同壓力下對重組Brazzein的回收率Fig.6 Recovery of recombinant Brazzein by three nanofiltrationmembranes at different pressures

表1 重組Brazzein與蔗糖的甜度關(guān)系感官評定結(jié)果Table 1 Sensory evaluation results of the sweetnessrelationship between recombinant Brazzein and sucrose

通過Friedman檢驗計算可知，F(xiàn)=10.044>F0.05=9.49，在0.05的置信水平下，5種溶液的甜度存在顯著差異。根據(jù)排序結(jié)果，甜度排名為A>B>E>C>D。進一步分組比較分析(least significance difference,LSD)，結(jié)果表明B和E之間沒有顯著差異。表明0.5 g/L的蛋白樣品溶液甜度與20 g/L蔗糖無明顯差異(P>0.05)，通過計算，甜味蛋白的甜度約為蔗糖的40倍。而后進行重組Brazzein的甜味和雜味檢測，結(jié)果表明,重組Brazzein具有明顯的甜味，同時反饋有苦味，增加空白對照后發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生苦味主要原因為超濾納濾純化過程未能將發(fā)酵液中苦澀物質(zhì)完全去除。另外，有2位評價員認為重組Brazzein的甜味持久性長于蔗糖。

3.6 重組Brazzein的抑菌作用

重組Brazzein對5種菌的抑制作用結(jié)果如表2所示。由表2可知，表達后的巴西甜蛋白對部分細菌和真菌抑菌性較弱，其中對白念珠菌的MIC值為15 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC值為7.5 mg/mL，對檜狀青霉的MIC值為3.75 mg/mL，對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌沒有發(fā)現(xiàn)明顯的抑菌效果。

表2 重組Brazzein抑菌作用結(jié)果Table 2 Antibacterial effect of recombinant Brazzein

4 結(jié)論與討論

本研究中重組畢赤酵母工程菌株分泌表達的巴西甜蛋白占總蛋白的80%以上。將巴西甜蛋白與PDI進行共表達在一定程度上減少了對宿主本身分子伴侶的占用，提高了重組蛋白的分泌效率，并最終實現(xiàn)了1 g/L的胞外分泌表達量，高于之前報道的385 mg/L蛋白產(chǎn)量[17]，為其他甜蛋白的外源表達提供了參考。

對獲得的重組巴西甜蛋白進行生物活性檢測，甜味測試結(jié)果顯示其甜度是蔗糖的40倍，與文獻報道的2 000倍存在差距，推測甜味降低的原因主要有2方面：1)宿主對關(guān)鍵氨基酸的修飾作用。由于巴西甜蛋白甜味主要由位于分子彈性環(huán)周邊包括Arg43的氨基酸殘基參與產(chǎn)生[18]，化學(xué)修飾其中部分位點會導(dǎo)致甜味的降低或消失[19]。而酵母對外源蛋白的糖基化修飾比較常見，也是許多外源蛋白活性降低的重要原因[20]。2)重組蛋白沒有正確折疊。甜蛋白的甜味同樣依賴于蛋白的正確折疊，經(jīng)畢赤酵母與PDI共表達的重組巴西甜蛋白是否與天然構(gòu)型完全一致還缺少研究。這也是下一步增強重組巴西甜蛋白甜味的主要研究方向。

對巴西甜蛋白的抑菌活性結(jié)果表明，巴西甜蛋白對部分細菌和真菌具有較弱的抑菌性，其中對白念珠菌的MIC值為15 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC值為7.5 mg/mL，對檜狀青霉的MIC值為3.75 mg/mL，而對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌沒有發(fā)現(xiàn)明顯的抑菌效果。根據(jù)以上實驗結(jié)果和預(yù)期的口服量分析，食用重組巴西甜蛋白后對腸道菌群影響作用較弱。