王昊玨 房靈 崔成軍 施啟豐 陸勝 陸顯義 高利增

1無(wú)錫市錫山人民醫(yī)院婦產(chǎn)科214105；2無(wú)錫市錫山人民醫(yī)院皮膚科214105；3無(wú)錫市錫山人民醫(yī)院病理科214105；4無(wú)錫市錫山人民醫(yī)院檢驗(yàn)科214105；5揚(yáng)州大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院225012

納米酶是具有類酶催化活性的納米材料，屬于新一代人工模擬酶。具有過(guò)氧化物酶或氧化酶活性的納米酶可以抑制多種細(xì)菌如大腸桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和變形鏈球菌的生長(zhǎng)［1-2］。我們之前的工作發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3O4納米酶具有過(guò)氧化物酶活性，可以分解H2O2生成自由基，在酸性條件下，通過(guò)誘導(dǎo)高水平的活性氧（ROS），殺死細(xì)菌，破壞生物膜的形成［3］，有望作為一種新型的抑菌制劑。本研究觀察Fe3O4納米酶對(duì)體外白念珠菌的作用，以期為白念珠菌感染的治療提供新的選擇。

一、材料與儀器

氯化鐵、葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、聚乙二醇、乙二醇（美國(guó)Sigma公司），醋酸鈉、戊二醛、30%H2O2［生工生物工程（上海）股份有限公司］。白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株（編號(hào)：AF206001，批號(hào)：20170721）購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

二、方法

1.納米酶的制備與表征：以水熱合成法［4-6］為基礎(chǔ)，適當(dāng)改進(jìn)后制備Fe3O4納米酶。取0.82 g 無(wú)水氯化鐵溶于40 ml乙二醇和聚乙二醇（1∶3）溶液中，緩慢加入3.6 g 三水醋酸鈉，快速攪拌，形成均勻懸濁液，超聲震蕩，充分混勻。將溶液轉(zhuǎn)移至50 ml聚四氟乙烯反應(yīng)釜，于200 ℃下加熱12 h，自然冷卻至室溫后，得到黑色沉淀物。采用乙醇和水分別洗滌產(chǎn)物3 次，于60 ℃干燥3 h 得到Fe3O4納米顆粒。取適量Fe3O4納米顆粒均勻分散在水溶液中，滴加于硅片上，常溫干燥后，掃描電鏡和透射電鏡觀察形貌。

2.白念珠菌培養(yǎng)及處理：配制沙氏固體培養(yǎng)基（含蛋白胨、瓊脂、葡萄糖）、沙氏液體培養(yǎng)基（含蛋白胨、葡萄糖）。采用沙氏液體培養(yǎng)基稀釋50 μl白念珠菌菌液至5 ml，37 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，使用沙氏液體培養(yǎng)基稀釋菌液至106CFU/ml作為標(biāo)準(zhǔn)菌懸液備用。根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［4］，采用0.5 g/L Fe3O4納米酶和0.1%H2O2與菌液共培養(yǎng)，分為納米酶組、H2O2組、聯(lián)合組（納米酶+H2O2共處理），以未做處理菌液為對(duì)照組。

3.納米酶對(duì)白念珠菌生長(zhǎng)的抑制作用：挑取4 組白念珠菌單克隆接種于5 ml 沙氏培養(yǎng)液，恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。1∶100轉(zhuǎn)接，每隔2 h檢測(cè)600 nm處吸光度（A值），繪制白念珠菌生長(zhǎng)曲線。每次設(shè)置3個(gè)平衡，取平均值。

4.納米酶對(duì)體外白念珠菌生長(zhǎng)的影響：采用平板稀釋法，取4 組菌液于4 只1.5 ml 無(wú)菌EP 管，處理2 h 后10 倍稀釋，混勻涂板，于36 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形成情況并計(jì)數(shù)。抑菌率=（對(duì)照組菌落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)）/對(duì)照組菌落數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5. 掃描電鏡觀察納米酶對(duì)白念珠菌形態(tài)的影響：取4 組經(jīng)過(guò)處理2 h后的菌液5 ml，4 000 r/min離心（離心半徑6 cm）3 ～5 min，生理NaCl溶液清洗3遍，棄上清液，2.5%戊二醛固定，于4 ℃冰箱中固定2 h 以上，生理NaCl 溶液沖洗2 ～3遍。采用梯度濃度的乙醇溶液脫水，經(jīng)干燥、黏樣、噴金導(dǎo)電后，采用掃描電鏡觀察、拍照。

6. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用GraphPad Prism7 軟件，計(jì)量資料采用±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、結(jié)果

1.Fe3O4納米酶的形態(tài)：透射電鏡下觀察到大量單個(gè)分散的黑色納米酶顆粒，大致呈圓形，表面有大小一致的小突起，粒徑均勻，平均直徑約120 nm。見(jiàn)圖1。

2.納米酶對(duì)白念珠菌生長(zhǎng)的影響：白念珠菌前22 h 處于生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，22 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，36 h時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期。聯(lián)合組白念珠菌前2 h有生長(zhǎng)，后均受到抑制。見(jiàn)圖2。

對(duì)照組、H2O2組、Fe3O4納米酶組、聯(lián)合組的菌落計(jì)數(shù)分別為124 830 ± 45 170、86 330 ± 13 960、91 670 ± 31 370、30 330±3 010，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.41，P ＜0.05），聯(lián)合組低于對(duì)照組、H2O2組、納米酶組（t=4.63、8.08、4.27，P ＜0.05），H2O2組、納米酶組和對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.82、1.34，P ＞0.05）。

H2O2組、納米酶組、聯(lián)合組的抑菌率分別為30.84% ±5.00%、26.57%±11.24%、75.70%±2.42%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.413，P=0.0004），聯(lián)合組抑菌率高于H2O2組、納米酶組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.08、4.27，P ＜0.05）；H2O2組與納米酶組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.35、4.27，P=0.74）。

3.納米酶對(duì)白念珠菌形態(tài)的影響：處理2 h后掃描電鏡觀察，對(duì)照組白念珠菌菌體飽滿，可見(jiàn)出芽生殖；H2O2組、Fe3O4納米酶組可見(jiàn)菌體稍皺縮；聯(lián)合組菌體明顯變形、崩解。見(jiàn)圖3。

四、討論

圖1 電鏡下納米酶顆粒形態(tài) 1A：掃描電鏡下為單個(gè)分散的黑色納米酶顆粒，大致呈圓形，尺寸均一（×4 000）；1B：透射電鏡下平均直徑為120 nm的顆粒，表面有大小一致的小突起（×5 000）

圖2 不同處理?xiàng)l件下白念珠菌生長(zhǎng)曲線 對(duì)照組白念珠菌前22 h處于生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，22 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，36 h時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期。納米酶組、H2O2組、聯(lián)合組白念珠菌的生長(zhǎng)均受到抑制

圖3 掃描電鏡觀察各組白念珠菌形態(tài) 3A：對(duì)照組見(jiàn)白念珠菌細(xì)胞呈圓形或卵圓形，可見(jiàn)出芽，直徑3 ～6 μm；3B：H2O2組見(jiàn)菌絲萎縮，活性減退；3C：納米酶組見(jiàn)菌絲進(jìn)一步萎縮，活性減退；3D：聯(lián)合組見(jiàn)菌絲裂解成碎屑狀

納米酶是一類新型的模擬酶，有特殊的抗菌作用。3% H2O2是常用的殺菌消毒劑，它能分解產(chǎn)生自由基，破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、核酸等活性組分，H2O2酶可加速產(chǎn)生自由基的效率。具有過(guò)氧化物模擬酶活性的納米材料就可有類似作用，提高H2O2產(chǎn)生自由基的效率，增強(qiáng)殺菌消毒的效果［7］。Falsetta 等［8］發(fā)現(xiàn)，納米鐵能損毀細(xì)菌生物膜，對(duì)口腔內(nèi)耐藥細(xì)菌具有較好的抑制作用，并在酸性環(huán)境中（pH 4.5 ～4.7）更加有效。在低濃度H2O2存在時(shí)，微量的納米酶即可殺滅100%大腸桿菌，而單獨(dú)使用H2O2殺菌效率低于15%［9］。

本研究采用水熱合成法制備Fe3O4納米酶顆粒，電鏡下觀察到Fe3O4納米酶大致呈圓形，表面有大小一致的小突起，粒徑均勻，平均直徑約120 nm，將其聯(lián)合H2O2作用于體外培養(yǎng)的白念珠菌，計(jì)算其抑菌率，并在電鏡下觀察白念珠菌形態(tài)。結(jié)果顯示，對(duì)照組白念珠菌具有相對(duì)穩(wěn)定的生存曲線，而納米酶組、H2O2組、聯(lián)合組白念珠菌的生長(zhǎng)均受到抑制，單用H2O2或納米酶對(duì)白念珠菌的抑菌率為30%左右，而聯(lián)合組可達(dá)75.70%，抑菌效力明顯增強(qiáng)。電鏡下觀察4 組白念珠菌的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)Fe3O4納米酶、H2O2作用的白念珠菌活性減退，而聯(lián)合組白念珠菌發(fā)生了崩解，提示Fe3O4納米酶聯(lián)合H2O2具有較強(qiáng)的抗白念珠菌能力。

基于本試驗(yàn)結(jié)果，F(xiàn)e3O4納米酶可能會(huì)成為一種全新的不同于其他藥物的抗菌制劑，從而用于白念珠菌感染的治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突