王 迪, 徐 楠, 郭家妍, 宋 躍, 唐明睿

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 整形外科, 遼寧 沈陽, 110001)

黑色素瘤是一種極具侵襲性的皮膚惡性腫瘤，其易發(fā)生淋巴和血行轉(zhuǎn)移，治療手段有限且預后極差[1-2]。小檗堿是一種中藥提取物，臨床上多用于治療胃腸道疾病。近年來，黃連素已被證實具有抑制多種癌癥細胞增殖、促使癌癥細胞凋亡的作用，如骨肉瘤細胞[3]、前列腺癌細胞[4]、肝癌細胞[5]和結(jié)腸癌細胞[6]。程序性細胞死亡蛋白4(PDCD4)是一種翻譯抑制蛋白，可在體內(nèi)外抑制腫瘤細胞增殖與侵襲[7-8]。1995年, Shibahara K等[9]在凋亡小鼠細胞系中發(fā)現(xiàn)了PDCD4基因。人類的PDCD4基因定位于染色體10q24, 互補DNA(cDNA)全長約3.5 kb, 其中編碼區(qū)約1.4 kb[10]。PDCD4編碼蛋白約含469個氨基酸，包含1個N端功能域和2個串聯(lián)MA3結(jié)構(gòu)域。突變分析及核磁共振波譜(NMR)分析[11-12]表明, PDCD4的2個MA3結(jié)構(gòu)域均可與真核翻譯起始因子4A(eIF4A)結(jié)合，抑制核糖體復合物的形成，抑制RNA解旋酶活性，從而抑制mRNA的翻譯及蛋白質(zhì)的合成，進而抑制腫瘤細胞增殖，促使腫瘤細胞凋亡。本研究探討小檗堿通過上調(diào)PDCD4的表達來抑制黑色素瘤細胞系B16的增殖及促細胞凋亡機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系和細胞培養(yǎng)

黑色素瘤細胞系B16購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC, Bethesda, MD)。該細胞系培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及抗生素(100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)的Dulbecco′s Modified Eagle′s培養(yǎng)基(Hyclone, Logan, UT), 并置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細胞活力測定

將黑色素瘤細胞系B16細胞按每孔2×103個細胞密度接種于96孔板中，并在37 ℃下與陰性對照[二甲基亞砜(DMSO)]及1、10、100 μmol/L小檗堿共培養(yǎng)48 h。小檗堿處理后48 h, 更換培養(yǎng)基并加入CCK-8溶液(碧云天)，繼續(xù)在37 ℃下再孵育4 h。采用全波長酶標儀測定450 nm下各孔吸光度。

1.3 PDCD4敲減

采用siRNA實驗法敲減PDCD4表達, siRNA購自吉滿生物科技(上海)有限公司。根據(jù)操作說明使用Lipofectamine TM 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)將siRNA轉(zhuǎn)染至B16細胞中。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)

使用TRIzol試劑(Invitrogen)提取細胞RNA, 參考說明書使用SuperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶 (Invitrogen)從1 μg總RNA中反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 而cMA3結(jié)構(gòu)域mRNA的qRT-PCR使用SYBR?Green PCR Master Mix試劑盒(Takara Dalian, Dalian, China)及ABI PRISM 7500 PCR儀器進行。引物如下: PDCD4, 上游引物: 5′-GTATGATGTGGAGGAGGTGGAT-3′; 下游引物: 5′-CCCTCCAATGCTAAGGATACTG-3′; GAPDH, 上游引物: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′; 下游引物: 5′-CATGGGTGGAATCATATTGGAA-3′。qRT-PCR條件: 95 ℃下運行15 s, 然后60 ℃下運行1 min, 共進行40個循環(huán)。每個樣品重復3次。

1.5 細胞周期檢測

將黑色素瘤細胞系B16細胞按每孔5×105個細胞密度接種于6孔板中，并用含DMSO或小檗堿(100 μmol/L)的培養(yǎng)基處理48 h。將細胞消化、離心棄上清，制成單細胞懸液使用預冷70%體積比(V/V)乙醇固定過夜，按照細胞周期試劑盒(碧云天)說明配制碘化丙啶(PI)染色液，之后用染色液在37 ℃水浴鍋內(nèi)孵育細胞，最后采用流式細胞儀(FACSCantoII, BD)檢測細胞周期并使用Modfit LT軟件進行繪圖及統(tǒng)計分析。

1.6 細胞凋亡測定

將對照組與敲減組的黑色素瘤細胞系B16細胞按每孔5×105個細胞密度接種于6孔板中，并用含DMSO或小檗堿(100 μmol/L)的培養(yǎng)基處理48 h。采用無乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶消化細胞，制成單細胞懸液。使用Annexin V-PI凋亡試劑盒(碧云天)對細胞進行染色標記，最后通過流式細胞儀(FACSCantoⅡ, BD)檢測細胞凋亡情況并使用Flowjo VX軟件進行繪圖及統(tǒng)計分析。

1.7 Western-blotting檢測蛋白表達

將對照組與敲減組的黑色素瘤細胞系B16細胞按每孔5×105個細胞密度接種于6孔板中，并用含DMSO或100 μmol/L氮烯唑胺(DTIC)的培養(yǎng)基處理48 h。之后于冰上使用RIPA蛋白裂解液[含苯甲基磺酰氟(PMSF)]提取細胞蛋白，使用BCA法進行蛋白定量配平，加入上樣緩沖液進行熱變性, -20 ℃保存。配置SDS-PAGE凝膠，每孔上樣20 μL, 電泳后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜), 5%脫脂奶粉封閉1 h后加一抗室溫孵育1 h后4 ℃過夜，一抗體濃度分別為PDCD4(CST, #9535)1∶1 000, Cleaved Caspase-3(CST, #9661)1∶1 000, Bax(CST, #2772)1∶1 000, Bcl-2(CST, #3498) 1∶1 000, β-actin (proteintech)1∶5 000, 次日復溫2 h后加二抗室溫孵育1 h, 最后加ECL發(fā)光液于Bio-Rad成像儀獲取條帶照片并使用Image J軟件進行分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 小檗堿對黑色素瘤B16細胞增殖及凋亡的影響

采用CCK-8法、流式細胞周期實驗、流式細胞凋亡實驗來驗證小檗堿抑制黑色素瘤B16細胞增殖及促凋亡作用。CCK-8法結(jié)果證明，小檗堿可以顯著抑制B16細胞的增殖活力(P<0.05或P<0.000 1), 且抑制水平是呈劑量依賴性的, 100 μmol/L的小檗堿對B16細胞的增殖活力已具有較強的抑制作用，適用于后續(xù)的細胞周期及凋亡研究。見圖1。流式細胞周期實驗結(jié)果顯示，小檗堿可將B16細胞的細胞周期阻滯于G0/G1期，說明細胞增殖被顯著抑制(P<0.001或P<0.000 1), 見圖2。流式細胞凋亡實驗結(jié)果證實, 100μmol/L小檗堿可顯著促進B16細胞凋亡(P<0.000 1), 見圖3。

與DMSO比較, *P<0.05, ****P<0.000 1。圖1 CCK-8法證實小檗堿可抑制B16細胞增殖活力(n=4)

A: DMSO處理的B16細胞周期分布; B: 100 μmol/L小檗堿處理的B16細胞48 h后的細胞周期分布; C: DMSO與100 μmol/L小檗堿處理B16細胞的細胞周期分布柱狀圖(n=4), 與DMSO比較, ***P<0.001, ****P<0.000 1。圖2 流式細胞儀檢測小檗堿處理B16細胞48 h后的細胞周期結(jié)果

A: DMSO處理的B16細胞凋亡情況; B: 100 μmol/L小檗堿處理的B16細胞凋亡情況; C: DMSO與100 μmol/L小檗堿處理的B16細胞凋亡柱狀圖(n=4), 與DMSO比較, ****P<0.000 1。圖3 流式細胞凋亡實驗證實小檗堿可顯著促進B16細胞凋亡

2.2 小檗堿經(jīng)上調(diào)PDCD4表達來抑制黑色素瘤B16細胞增殖并促其凋亡

Western-blotting實驗發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以上調(diào)B16細胞PDCD4的表達。通過siRNA敲低了B16細胞PDCD4的表達，并通過qRT-PCR驗證了siRNA2可以顯著抑制PDCD4的表達(P<0.001或P<0.000 1)。通過CCK-8法發(fā)現(xiàn), 100 μmol/L小檗堿對PDCD4敲低的B16細胞增殖的抑制作用幾乎消失(P<0.000 1)。見圖4。流式凋亡實驗結(jié)果顯示, 100 μmol/L小檗堿對PDCD4敲低的B16細胞的促凋亡作用顯著減弱，約為PDCD4敲低前的1/4。進一步通過Western-blotting實驗發(fā)現(xiàn)，小檗堿處理增加了Cleaved Caspase-3、Bax的表達水平，降低了Ki-67、Bcl-2的表達水平，而敲減PDCD4表達則能減弱小檗堿對B16細胞Bcl-2、Ki-67、Bax、Cleaved Caspase-3的影響，說明小檗堿抑制B16細胞增殖及促進其凋亡的原因是促進PDCD4表達上調(diào)。見圖5。

A: Western-blotting檢測小檗堿上調(diào)B16細胞PDCD4表達的蛋白印跡圖; B: siRNA敲低B16細胞PDCD4表達可顯著抑制PDCD4的表達(n=4), 與對照組細胞比較, ***P<0.001, ****P<0.000 1; C: 100 μmol/L小檗堿對PDCD4敲低的B16細胞增殖的抑制作用,與DMSO比較, ****P<0.000 1。圖4 小檗堿經(jīng)上調(diào)PDCD4抑制黑色素瘤B16細胞增殖

3 討 論

本研究表明，中藥黃連中分離的小檗堿能顯著抑制黑色素瘤B16細胞的增殖活力，小檗堿可將B16細胞的細胞周期阻滯于G0/G1期，小檗堿能誘導B16細胞凋亡。Western-blotting實驗中增殖相關(guān)蛋白Ki-67以及凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax的變化證明了小檗堿抑制B16細胞增殖、促細胞凋亡是通過上調(diào)PDCD4表達來實現(xiàn)的。作為傳統(tǒng)中藥的有效成分，小檗堿具有抗氧化及多種藥理特性。目前已發(fā)現(xiàn)小檗堿對腸胃炎、腹瀉、高脂血癥、肥胖癥、脂肪肝、冠狀動脈疾病、高血壓、糖尿病、多囊卵巢綜合征和阿爾茨海默氏癥有效[13]。體外研究[14]表明，小檗堿可抑制多種癌細胞的增殖和遷移，并可誘導癌細胞凋亡。

在各種人類癌癥中, PDCD4的表達均有不同程度的缺失或減少，如膠質(zhì)瘤[15]、口腔癌[16]、食管癌[17]、肺癌[18]、乳腺癌[19]、肝細胞癌[20]、胃癌[21]和大腸癌[22]。PDCD4是一種新型的腫瘤抑制因子[7], 過表達的PDCD4可抑制增殖相關(guān)基因Ki-67的表達，從而抑制腫瘤細胞增殖[16, 23]; 同時，過表達的PDCD4可激活Bcl-2/Bax/Caspase-3通路，促進腫瘤細胞凋亡[24-25]。本課題組前期研究[26]證實黑色素瘤組織中的PDCD4表達水平顯著低于正常組織，過表達PDCD4基因可促進黑色素瘤B16細胞的凋亡。本研究探討小檗堿對黑色素瘤B16細胞增殖、凋亡的影響，并證實PDCD4是小檗堿作用的一個分子靶點。本研究有助于黃連素的進一步開發(fā)，并為小檗堿治療黑色素瘤提供初期實驗基礎(chǔ)。