孫 杰，俞 麗，趙宜雙，金 華，高永平，金萬昆

(1.天津市換新水產(chǎn)良種場(chǎng)，天津 寧河 301500；2.農(nóng)業(yè)部天津鯉鯽魚遺傳育種中心，天津 寧河 301500；3.天津市淡水魚類遺傳育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 寧河 301500)

為尋找鯽魚良種種源，培育出天然、綠色鯽魚品種，天津市換新水產(chǎn)良種場(chǎng)自2005年開始，先后多次赴內(nèi)蒙古貝爾湖尋找收集該湖野生鯽魚資源。2014年9月在當(dāng)?shù)貪O民幫助下，從該湖成功引進(jìn)野生鯽魚(Carassiusauratusgibelio)46尾，總體重20.48 kg，尾均重445.21 g。依其產(chǎn)地，將其命名為“貝爾鯽(Carassiusauratusgibelio‘Buir’)”。為進(jìn)一步了解貝爾鯽的遺傳學(xué)特性，對(duì)其進(jìn)行了倍性和染色體核型的初步研究，以期為合理保護(hù)和開發(fā)利用貝爾鯽自然種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)魚是天津市換新水產(chǎn)良種場(chǎng)2014年9月引進(jìn)的貝爾鯽，經(jīng)池塘飼養(yǎng)越冬后，于2015年3月21日對(duì)28尾貝爾鯽(全長(zhǎng)24.0～27.5 cm、體長(zhǎng)19.0～23.7 cm、體重222～589 g)進(jìn)行采血鑒定倍性。確定倍性后，同年5月用三倍體貝爾鯽催產(chǎn)繁殖后獲得F1，培育至秋片魚種。隨機(jī)對(duì)388尾貝爾鯽F1(體重106 g)進(jìn)行采血確定倍性，并對(duì)其中的15尾(體長(zhǎng)13.76～14.70 cm，平均14.31 cm；體重87～111 g，平均99.75 g)進(jìn)行染色體制備，確定染色體數(shù)目和核型。

1.2 倍性的觀察方法

1.2.1 紅細(xì)胞玻片的制備及測(cè)量 采用尾柄部取血，制成血液玻片，經(jīng)甲醇固定后，用Giemsa染色15 min，空氣干燥后，在Nikon Eclipse E200顯微鏡15×100油鏡下測(cè)量紅細(xì)胞及紅細(xì)胞核的短徑(a)和長(zhǎng)徑(b)，用公式a×b×π/4計(jì)算紅細(xì)胞的面積及紅細(xì)胞核的面積，用公式a2×b/1.91計(jì)算紅細(xì)胞核的體積[1]。每尾魚測(cè)定32個(gè)紅細(xì)胞，求出每個(gè)個(gè)體紅細(xì)胞的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析差異顯著性。依據(jù)小野里坦[2]和董仕[3]的標(biāo)準(zhǔn)，判斷貝爾鯽的倍性。

1.2.2 染色體標(biāo)本的制備和核型分析 實(shí)驗(yàn)前一周將魚放入室內(nèi)充氧的水族箱(0.9 m×0.4 m×0.6 m)中暫養(yǎng)，水溫控制在(20±1)℃。暫養(yǎng)3 d后參照林義浩的方法[4]，在試驗(yàn)魚的胸鰭基部注射小牛血清和植物血球凝集素(PHA)，注射劑量為0.5 mL/100 g魚體重量，植物血球凝集素(PHA)劑量為1 μg/g魚體重量。12 h后注射秋水仙素，劑量為1 μg/g魚體重。3 h后殺魚放血，取頭腎，用生理鹽水清洗，置于裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，用鑷子反復(fù)撕碎，然后取細(xì)胞懸浮液于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入0.5% KCl低滲液并吹打均勻，室溫下低滲40 min，隨后1 000 r/min離心5 min收集沉淀，加入新配置的卡諾氏液(冰醋酸∶甲醇=1∶3)固定15 min后，再以1 000 r/min離心5 min，重復(fù)固定并離心2次，完成后棄去上清液，加入少量卡諾氏固定液(冰醋酸∶甲醇=1∶1)制成細(xì)胞懸液，將其保持一定高度均勻滴在經(jīng)過預(yù)冷的載玻片上，制成染色體標(biāo)本，空氣干燥后用Giemsa液染色30 min，沖洗后自然晾干，鏡檢。

染色體的分類及測(cè)量：將制備好的染色體標(biāo)本放于Nikon Eclipse E200雙筒顯微鏡下觀察，選取分散良好，形態(tài)清晰的分裂相，用Discovery C15顯微攝像頭，通過ISCapture軟件在計(jì)算機(jī)上拍照并計(jì)數(shù)每個(gè)中期分裂相的染色體數(shù)，統(tǒng)計(jì)染色體眾數(shù)。從中選取5個(gè)完整、形態(tài)清晰的分裂相，用A4紙打印放大后進(jìn)行染色體組型分析。計(jì)算每對(duì)染色體的臂比和著絲點(diǎn)指數(shù)。染色體分類、分組的標(biāo)準(zhǔn)參照Levan等[5]提出的標(biāo)準(zhǔn)，臂比=長(zhǎng)臂/短臂。按Matthey[6]的方法進(jìn)行染色體臂數(shù)(NF)的統(tǒng)計(jì)，中部和亞中部著絲粒染色體的臂數(shù)計(jì)為2，亞端部和端部著絲粒染色體臂數(shù)計(jì)為1。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞測(cè)量結(jié)果與倍性

2.1.1 貝爾鯽的倍性 通過血細(xì)胞測(cè)定，在28尾魚中，紅細(xì)胞長(zhǎng)徑在10.73～13.66 μm，平均為(12.21±1.46)μm的有3尾，紅細(xì)胞長(zhǎng)徑在14.69～16.14 μm，平均為(15.23±0.46)μm的有25尾，可以作為判別二倍體和三倍體貝爾鯽的方法(見封三圖1)。由表1可見，三倍體貝爾鯽各項(xiàng)數(shù)值都高于二倍體。三倍體紅細(xì)胞長(zhǎng)徑、短徑、面積、體積分別為二倍體的1.25，1.07，1.33，1.42倍，三倍體紅細(xì)胞核長(zhǎng)徑、短徑、面積、體積分別為二倍體的1.20，1.03，1.23，1.25倍。

表1 三倍體與二倍體貝爾鯽紅細(xì)胞及紅細(xì)胞的測(cè)量值

通過性別鑒別，在28尾中，雌魚23尾，占82.14%；雄魚5尾，占17.86%。23尾雌魚中，二倍體的3尾，體重293～316 g，平均為301.67 g；三倍體的20尾，體重222～589 g，平均為438.9 g。5尾雄魚，均為三倍體，體重250～352 g，平均為298.8 g。

2.1.2 F1代的倍性 通過對(duì)388尾貝爾鯽F1紅細(xì)胞長(zhǎng)徑的測(cè)量，結(jié)果是紅細(xì)胞長(zhǎng)徑平均為(17.19±0.43)μm，最小15.64 μm，最大19.03 μm，由此確定為三倍體。

2.2 染色體數(shù)及組型

對(duì)15尾貝爾鯽頭腎組織中的166個(gè)中期分裂相進(jìn)行了計(jì)數(shù)分析。結(jié)果表明，染色體數(shù)為156條的有69個(gè)細(xì)胞，占41.57%；染色體數(shù)少于156的有58個(gè)細(xì)胞，占34.94%，染色體數(shù)多于156的有39個(gè)細(xì)胞，占23.49%；染色體數(shù)分布較散，但156條染色體數(shù)相對(duì)集中，故將貝爾鯽染色體數(shù)定為156條，同時(shí)還存在一些小染色體。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。

表2 貝爾鯽的染色體數(shù)目

2.3 貝爾鯽的染色體核型

測(cè)量了5個(gè)貝爾鯽細(xì)胞分裂相的染色體長(zhǎng)臂和短臂，分別計(jì)算出每條染色體的臂比和著絲點(diǎn)指數(shù)，結(jié)果見表3。按照Levan[5]標(biāo)準(zhǔn)配成中部著絲粒染色體(m)14對(duì)；亞中部著絲粒染色體(sm)16對(duì)；亞端部著絲粒染色體(st)9對(duì)；端部著絲粒染色體(t)13對(duì)。核型公式為3n=156，42 m+48 sm+27 st +39 t，NF=246，見圖2(封三)。

表3 貝爾鯽染色體核型數(shù)據(jù)

3 討論

據(jù)中國(guó)鯉科魚類志(下卷)記載，鯽屬(Carassius)在中國(guó)有2個(gè)種，分別是黑鯽(C.carassius)和鯽(C.auratu)，鯽又分為普通鯽(C.a.auratus)和銀鯽(C.a.gibelio)2個(gè)亞種，銀鯽在中國(guó)主要分布于黑龍江和額爾齊斯河等水系[7～10]。在我國(guó)不同地區(qū)的鯽存在不同的倍性和不同的生殖方式[11]：有的為二倍體，以兩性型生殖，如野鯽；有的為三倍體，以雌核發(fā)育生殖，如方正銀鯽、彭澤鯽。2014年我場(chǎng)引進(jìn)貝爾湖野生鯽魚，通過測(cè)量血細(xì)胞和紅細(xì)胞核的大小來鑒別倍性的方法可知，在28尾貝爾鯽中二倍體有3尾，三倍體有25尾，說明在貝爾湖中棲息著2種倍性的鯽魚，且在三倍體群體中有雌雄兩性個(gè)體。沈俊寶等[11-12]報(bào)道的在黑龍江不同水系中有2n=100和2n=150兩種類型的銀鯽，甚至在同一水域也有這兩個(gè)種群并存的現(xiàn)象。生活在貝爾湖中的鯽魚與生活在黑龍江水系中的鯽魚倍性和生殖方式是否存在相同的現(xiàn)象還有待于進(jìn)一步研究。

關(guān)于銀鯽染色體數(shù)目的報(bào)道結(jié)果不一致，并且核型和染色體臂數(shù)也不同。如國(guó)外報(bào)道的二倍體為100，三倍體有150和156[13-15]；日本銀鯽(Carassiusauratuslangsdorfii)三倍體為156，四倍體為206[16]。國(guó)內(nèi)報(bào)道的銀鯽染色體數(shù)有156和162[17-20]，其中單仕新和蔣一圭(1988)發(fā)現(xiàn)銀鯽中染色體數(shù)為162，且有8～12個(gè)小染色體，昝瑞光(1982)報(bào)道滇池高背型鯽具有10±個(gè)超數(shù)染色體。通過對(duì)生活在貝爾湖中的三倍體鯽魚核型分析，可知其染色體數(shù)為156，核型公式為3n=42 m+48 sm+27 st+39 t，染色體臂數(shù)(NF)為246，也發(fā)現(xiàn)有小染色體。此外，銀鯽染色體數(shù)目的眾數(shù)比例較低，滇池高背型鯽的標(biāo)準(zhǔn)染色體數(shù)為162，眾數(shù)百分率為45.9%，沈俊寶等[17]報(bào)道的銀鯽染色體數(shù)為156，眾數(shù)百分率為40.6%。本文對(duì)15尾貝爾鯽的166個(gè)分裂相計(jì)數(shù)結(jié)果表明，染色體數(shù)少于156的占34.94%；染色體數(shù)多于156的占23.49%，染色體數(shù)為156條的占41.57%，確定貝爾鯽染色體數(shù)為156，明顯低于眾數(shù)應(yīng)占檢測(cè)細(xì)胞數(shù)75%以上的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。鑒于銀鯽染色體數(shù)目變異幅度大和眾數(shù)百分率低這一特殊性，推測(cè)銀鯽可能是一種嵌合的非整倍多倍體魚類，而貝爾鯽與其它類型鯽魚在遺傳上有無差異，還需要通過多種分子遺傳標(biāo)記檢測(cè)來證明。