,2,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642;2.畜禽產(chǎn)品精準(zhǔn)加工和安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,廣東廣州 510642)

2107年我國(guó)禽肉產(chǎn)量為2344.82萬(wàn)t,其中雞肉占63%,達(dá)1477萬(wàn)t[1]。分割是目前我國(guó)肉雞加工的主要方式,雞胸肉是肉雞分割中價(jià)格較低廉的產(chǎn)品。雞雞胸肉具有高蛋白、低脂肪、多維生素和微量元素的特點(diǎn),是一種富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的食材,每100 g雞肉中含有蛋白質(zhì)21.73 g[2],雞肉蛋白質(zhì)的氨基酸組成比例平衡,檢測(cè)得到鮮味氨基酸和抗氧化性氨基酸含量較高[3]。

本文在前期研究得出雞肉鹽溶蛋白酶解物SSPH(Salt-Soluble Protein Hydrolysate,SSPH)和雞肉肌纖蛋白酶解物MFH(Muscle Fibrin Hydrolysate,MFH)具有良好體外抗氧化效果的基礎(chǔ)上[10,15],開(kāi)展了HepG2細(xì)胞抗氧化和小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞胸肉(黃羽肉雞) 廣州市江豐實(shí)業(yè)股份有限公司卓味家禽加工廠(chǎng)提供;酸性蛋白酶(10萬(wàn)U/g,實(shí)測(cè)9.8萬(wàn)U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;人肝癌細(xì)胞株HepG2 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù);昆明種雄性小白鼠(Specific pathogen Free,SPF級(jí)) 廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2013-0002];舒克貝塔實(shí)驗(yàn)鼠維持飼料(小鼠飼料)[全價(jià)顆粒飼料,生產(chǎn)許可證:蘇飼證(2014)01008,營(yíng)養(yǎng)成分執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):GB 14924.3-2010,其中,飼料中的粗蛋白含量≥180 g/kg] 江蘇省協(xié)同醫(yī)生物工程有限責(zé)任公司;過(guò)氧化氫酶試劑盒(貨號(hào):A007-1-1)、超氧化物歧化酶試劑盒(貨號(hào):A001-3)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒(貨號(hào):A005) 南京建成生物工程研究所;DMSO(Dimethyl sulfoxide二甲基亞砜)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS);青-鏈霉素溶液(雙抗)、DEME高糖培養(yǎng)基;HBSS(Hank’s Balanced Salt Solution,Hank’s平衡鹽溶液)、PBS(Phosphate buffered solution,磷酸鹽緩沖液) 均為細(xì)胞級(jí),Gibco公司;MTT[Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽]、AAPH(2,2′-azobis[2-methylpropionamidine]dihydrochloride,偶氮二異丁脒鹽酸鹽)、熒光素鈉、DCFH-DA(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽) 均為細(xì)胞級(jí),Sigma公司;其他試劑和藥品 均為分析純。

多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)PerkinElmer;Costa 96孔板美國(guó)Corning;25 cm2-透氣蓋細(xì)胞培養(yǎng)瓶 美國(guó)Corning;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 新加坡ESCO;UV1240分光光度計(jì) 島津;DY89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī) 寧波新芝公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸性蛋白酶酶解制備雞肉酶解產(chǎn)物 以雞胸肉為原料,經(jīng)特定工藝提取雞肉鹽溶蛋白(Salt-Soluble Protein,SSP)及雞肉肌纖蛋白(Muscle Fibrin,MF),經(jīng)酸性蛋白酶酶解制備獲得深度酶解的雞肉鹽溶蛋白酶解物SSPH和肌纖蛋白酶解物MFH。SSP酶解條件:底物濃度為7.0%(w/v)蛋白質(zhì)含量、E∶S=1 ku/g蛋白質(zhì)、溫度45 ℃、pH4.0、酶解8 h,酶解物中肽(含氮物)含量27.33 mg/mL;MF酶解條件:底物濃度為7.0%(w/v)蛋白質(zhì)含量、E:S=3 ku/g蛋白質(zhì)、溫度45 ℃、pH4.5、酶解8 h,酶解物中肽(含氮物)含量32.31 mg/mL。采用高效凝膠色譜法(色譜柱:TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm)對(duì)SSPH及FMH進(jìn)行分子量分布檢測(cè),結(jié)果如表1所示。

表1 雞肉酶解物SSPH與MFH分子量分布所占百分含量(%)Table 1 The molecular weight distribution ofchicken enzymatic lysates SSPH and MFH(%)

1.2.2 雞肉酶解物HepG2細(xì)胞的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2細(xì)胞按常規(guī)方法復(fù)蘇后,置于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺和1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)液中,37 ℃、5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),隔天更換培養(yǎng)液,待細(xì)胞貼壁融合率達(dá)80%左右時(shí),用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02% EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞,按1∶3傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[16]。

表2 小鼠實(shí)驗(yàn)分組表Table 2 Mice experimental grouping table

1.2.2.2 雞肉酶解物對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響 為避免雞肉酶解物對(duì)細(xì)胞的毒性作用,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的樣品濃度,進(jìn)行不同濃度條件下樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的存活率實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞配制成濃度為6×104個(gè)/mL的懸液,接種到Costa 96孔板中,每孔加100 μL,于培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)基,用PBS清洗細(xì)胞3次,樣品組加入雞肉酶解物,使培養(yǎng)孔中樣品最終濃度分別為50、125、250、500、1000 μg/mL,對(duì)照組加入相同體積的無(wú)FBS培養(yǎng)液,每組設(shè)置5個(gè)平行孔,分別于24、48、72、96 h在每孔中加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT試劑,4 h后吸出培養(yǎng)液,加入DMSO 150 μL溶解沉淀,測(cè)定490 nm處吸光值,按照式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率[17]。

式(1)

式中:As:樣品組吸光值;Ab:對(duì)照組吸光值;Ac:空白組吸光值。

1.2.2.3 雞肉酶解物對(duì)HepG2細(xì)胞的熒光強(qiáng)度影響 采用細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度測(cè)定法,參考文獻(xiàn)[18]。取對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞,接種于Costa 96孔板,每孔100μL,約6×104個(gè)/mL,加入用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋好的DCFH-DA液100 μL與樣品溶液,使得DCFH-DA終濃度為25 μmol/L,雞肉酶解物最終濃度為12.5、25、50、75、125、250 μg/mL,每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)孔,在37 ℃,5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min后棄去培養(yǎng)液,加入濃度600 μmol/L ABAP液100 μL,反應(yīng)10 min,用多功能酶標(biāo)儀測(cè)其熒光值TC。測(cè)定條件:溫度37 ℃,發(fā)射波長(zhǎng)538 nm,激發(fā)波長(zhǎng)485 nm,每5 min測(cè)定一次,跟蹤測(cè)定1 h,得到熒光值TC。用 DCFH-DA溶液與含有濃度600 μmol/L的AAPH的HBSS液處理的細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照PC;用DCFH-DA溶液與不含有AAPH的HBSS處理的細(xì)胞為陰性對(duì)照NC。

1.2.2.4 雞肉酶解物對(duì)HepG2細(xì)胞的抗氧化活性影響 用Origin 8.0軟件計(jì)算時(shí)間-熒光強(qiáng)度曲線(xiàn)下的積分面積,并按照式(2)計(jì)算細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性值(cellular antioxidant activity,CAA)。

式(2)

1.2.3 雞肉酶解物對(duì)小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

1.2.3.1 實(shí)驗(yàn)小鼠準(zhǔn)備 選用4周齡雄性成年昆明種小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)(溫度保持22±2 ℃,相對(duì)濕度保持50%±10%,噪音<60 dB,模擬白天和晚上的時(shí)間間隔為12 h,自由進(jìn)食和飲水);一周后,體重達(dá)(27±0.6) g,開(kāi)始實(shí)驗(yàn)[19]。

1.2.3.2 實(shí)驗(yàn)小鼠分組 將60只小鼠隨機(jī)分為6組,每組10只,實(shí)驗(yàn)前逐只稱(chēng)重,使組間初重差異不顯著(P>0.05)。設(shè)置生理鹽水對(duì)照組(Saline control,SC)和雞肉勻漿對(duì)照組(chicken homogenate control)CHC;實(shí)驗(yàn)組為SSPH和MFH,分別設(shè)置40和200 mg/kg·bw·d兩個(gè)劑量,每只胃飼(灌胃方法)容量均0.2 mL/d[4]。實(shí)驗(yàn)分組如表2所示。

1.2.3.3 小鼠飼養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)小鼠集中飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證編號(hào):SYXK(粵)2014-0136]。每天上午10:00～11:00按時(shí)胃飼,定期稱(chēng)重,實(shí)驗(yàn)為期28 d。

1.2.3.4 血清抗氧化酶活性測(cè)定 末次小鼠胃飼后經(jīng)30 min休息,將小鼠放入放于水深為30 cm,水溫為(25±1) ℃的實(shí)驗(yàn)水箱中游泳30 min后取出,目?jī)?nèi)眥靜脈采血,血液經(jīng)3000 r/min離心10 min,收集上層血清,用于測(cè)定各項(xiàng)抗氧化酶活性。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)的活性測(cè)定:采用分光光度法,分別參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。其中,GSH-Px酶活定義為扣除非酶促反應(yīng)作用,使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個(gè)酶活力單位(U);SOD酶活,以SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD活力單位(U);CAT酶活為反應(yīng)體系中1 mL血清1 s分解1 μmol/L的H2O2的量為一個(gè)活力單位(U)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19、統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析ANOVA,組間比較用LSD法,采用Origin 8進(jìn)行面積積分計(jì)算,用Excel進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞肉酶解物對(duì)HepG2細(xì)胞抗氧化活性的影響

2.1.1 雞肉酶解物濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響 為了解雞肉酶解物是否對(duì)HepG2細(xì)胞存在毒性作用,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的樣品濃度,進(jìn)行不同濃度條件下樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的存活率實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 雞肉酶解物濃度對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of chicken enzymatic hydrolysatesconcentration on the survival rate of HepG2 cells

圖1結(jié)果顯示,雞肉酶解物SSPH濃度在50～500 μg/mL范圍內(nèi),HepG2細(xì)胞的成活率均介于87.02%～89.87%;MFH濃度在50～250 μg/mL范圍內(nèi),HepG2細(xì)胞的成活率均大于90%,濃度500 μg/mL時(shí)降為84.50%,濃度增加導(dǎo)致細(xì)胞成活率降低。圖1結(jié)果表明,雞肉酶解物SSPH及MFH對(duì)HepG2細(xì)胞均不存在毒性,高濃度條件下細(xì)胞成活率降低,應(yīng)該是因?yàn)楦邼B透壓引起的。

2.1.2 雞肉酶解物對(duì)HepG2細(xì)胞抗氧化活性的影響

2.1.2.1 雞肉酶解物對(duì)HepG2細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的影響 雞肉酶解物對(duì)HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 雞肉酶解物對(duì)HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of chicken enzymatic hydrolysateson fluorescence intensity of HepG2 cells

圖2結(jié)果顯示,HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度隨雞肉酶解物濃度的增加而呈下降趨勢(shì),且雞肉酶解物對(duì)HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度與空白組相比均有顯著性差異(P<0.05)。DCFH-DA是非標(biāo)記性的氧化敏感的熒光探針,本身無(wú)熒光,可穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后,被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解，生成不能通透細(xì)胞膜且無(wú)熒光的DCFH,DCFH-DA熒光探針很容易地被裝載到細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的ABAP裂解成活性氧(ROS),可將DCFH氧化生成帶有熒光的DCF,通過(guò)檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度來(lái)判斷細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平,熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平呈正比。圖2結(jié)果表明,雞肉酶解物SSPH及MFH均能顯著降低(P<0.05)HepG2細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度,消除細(xì)胞內(nèi)活性氧,提示SSPH及MFH均有明顯的抗氧化活性,且呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。細(xì)胞抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中采用ABAP作為自由基來(lái)源,其產(chǎn)生的自由基性質(zhì)更接近于生物體自然狀態(tài)下產(chǎn)生的自由基,因此可以更好地分析抗氧化物質(zhì)對(duì)由自由基引起的生物膜和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)損失的抑制作用[20-21]。

2.1.2.2 雞肉酶解物對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞抗氧化活性的影響 CAA是一種模擬生理?xiàng)l件,基于細(xì)胞模型的抗氧化實(shí)驗(yàn)方法[22]。將雞肉酶解物對(duì)HepG2細(xì)胞的熒光強(qiáng)度用Origin 8.0軟件進(jìn)行積分面積,獲得雞肉酶解物抑制ROS氧化DCFH的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn),結(jié)果如圖3所示。

圖3結(jié)果顯示,雞肉酶解物SSPH及MFH均有明顯的抗氧化活性,并且存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系,即抗氧化效果隨SSPH及MFH濃度的增加而增強(qiáng),當(dāng)SSPH及MFH的濃度為150 μg/mL時(shí),CAA值分別達(dá)到43.17%和46.64%,250 μg/mL時(shí),CAA值分別達(dá)到48.03%和47.95%。結(jié)果表明,雞肉酶解物SSPH、MFH均具有良好的細(xì)胞ROS清除能力,且具有量效關(guān)系;雞肉酶解物MFH的清除細(xì)胞ROS能力比同等濃度的SSPH高。劉艷等[23]對(duì)烏雞低聚肽的細(xì)胞抗氧化研究結(jié)果顯示,最佳的抗氧化濃度達(dá)1000 μg/mL,Halldorsdottir等[24]研究的鱈魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物的ROS最強(qiáng)清除能力40%,因此,本研究雞肉酶解物的細(xì)胞抗氧化效果更優(yōu)。

2.3 雞肉酶解物對(duì)小鼠血清抗氧化酶活性的影響

雞肉酶解物小鼠血清SOD、CAT及GSH-Px等抗氧化酶活性的影響結(jié)果如表3所示。

表3 雞肉酶解物對(duì)小鼠血清抗氧化酶活性的影響Table 3 Effect of chicken enzymatic hydrolysates on antioxidative enzyme activity of mouse serum

圖3 雞肉酶解物抑制ROS氧化DCFH的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)圖Fig.3 Dose-effect curve of chicken enzymatichydrolysates inhibiting ROS oxidation of DCFH

表3結(jié)果顯示,雞肉勻漿對(duì)照組除GSH-Px酶活顯著高于(P<0.05)生理鹽水對(duì)照組外,SOD及CAT酶活均差異不顯著(P>0.05)。高劑量SSPH小鼠血清中的SOD、CAT及GSH-Px三種抗氧化酶酶活性均極顯著高于(P<0.01)生理鹽水對(duì)照組及雞肉勻漿對(duì)照組;低劑量SSPH小鼠血清SOD酶活顯著高于(P<0.05)雞肉勻漿及生理鹽水對(duì)照組,GSH-Px酶活極顯著高于(P<0.01)生理鹽水對(duì)照組,但與雞肉勻漿組間差異不顯著,CAT酶活與兩個(gè)對(duì)照組間差異不顯著(P>0.05)。高劑量MFH小鼠血清中的SOD及GSH-Px兩種抗氧化酶活性均極顯著高于(P<0.01)雞肉勻漿對(duì)照組及生理鹽水對(duì)照組,CAT酶活顯著高于(P<0.05)兩對(duì)照組;低劑量MFH小鼠血清SOD及CAT酶活顯著高于(P<0.05)生理鹽水對(duì)照組,GSH-Px酶活極顯著高于(P<0.01)生理鹽水對(duì)照組,而與高劑量雞肉勻漿對(duì)照組相比,三種抗氧化酶的酶活均差異不顯著(P>0.05)。生物體代謝過(guò)程中通常伴隨著產(chǎn)生自由基,它們會(huì)損傷蛋白質(zhì)、核酸、物膜,加速機(jī)體的衰老和死亡。生物體內(nèi)有一套完善的抗氧化酶系統(tǒng),使自由基的產(chǎn)生與消除處于動(dòng)態(tài)平衡。生物抗氧化酶系統(tǒng)的主要成員包括:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等[25]。研究結(jié)果表明,雞肉蛋白質(zhì)經(jīng)深度酶解處理后,能夠有效提高其對(duì)小鼠抗氧化酶活性。研究結(jié)果與林琳等[26]、Sun等[27]及Nazeer等[28]的研究成果相一致,動(dòng)物源性蛋白質(zhì)酶解物具有較強(qiáng)的抗氧化活性,表現(xiàn)在提高小鼠或大鼠血液中SOD、CAT和GSH-Px的活力,通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶的活力,增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力,維持著機(jī)體內(nèi)部氧化-抗氧化作用的動(dòng)態(tài)平衡,保證生物體的正常生命活動(dòng)。

3 結(jié)論

通過(guò)雞肉酶解物SSPH及MFH對(duì)HepG2細(xì)胞抗氧化活性分析,結(jié)果顯示,當(dāng)SSPH及MFH的濃度為150 μg/mL時(shí),細(xì)胞抗氧化活性CAA值分別達(dá)到43.17%和46.64%,表明二者均具有良好的HepG2細(xì)胞ROS清除能力,且呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在HepG2細(xì)胞培養(yǎng)中,雞肉酶解物SSPH和MFH的添加濃度為500 μg/mL時(shí),HepG2細(xì)胞的成活率為84.50%和89.87%,雞肉酶解物對(duì)HepG2細(xì)胞均不存在毒性。細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組的HepG2細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度均顯著低于(P<0.05)空白對(duì)照組,并隨雞肉酶解物濃度增加而降低。通過(guò)雞肉酶解物SSPH及MFH對(duì)小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性的分析,結(jié)果顯示,胃飼劑量為40 mg/kg·bw·d的SSPH組的CAT酶活性與生理鹽水及雞肉勻漿對(duì)照組間差異不顯著,給小鼠胃飼雞肉酶解物SSPH及MFH劑量為200 mg/kg·bw·d后,小鼠血清中的SOD、CAT及GSH-Px抗氧化酶活性均極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)高于生理鹽水對(duì)照組及同劑量雞肉勻漿對(duì)照組,表明雞肉酶解物SSPH及MFH能有效提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性,促進(jìn)實(shí)驗(yàn)小鼠的體內(nèi)抗氧化能力。