,*,2

(1.山西振東制藥股份有限公司,山西長(zhǎng)治 046000;2.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院,山西晉中 030600)

苦蕎麥(Fagopyrumtataricum(L.)Gaertn)為蕎麥屬(蓼科)植物,是我國(guó)的重要小宗雜糧作物。其蛋白質(zhì)、脂肪以及多種維生素和礦物質(zhì)含量普遍高于其他禾谷類作物,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高,且富含蘆丁、槲皮素等黃酮類活性成分[1-3],具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等作用[4-9]。利用苦蕎麥開發(fā)的食品越來越受到消費(fèi)者喜愛,苦蕎茶因食用方便、風(fēng)味獨(dú)特,更是倍受青睞。李紅梅等[10]將苦蕎茶分為米茶型和造粒型兩類,分別測(cè)定其總黃酮含量,并按照分類進(jìn)行比較分析。黃艷菲等[11]采用HPLC法測(cè)定不同商品苦蕎茶中蘆丁的含量,結(jié)果表明全胚茶中蘆丁含量最高?？嗍w中的黃酮成分主要是蘆丁和槲皮素,同時(shí)測(cè)定苦蕎茶中蘆丁和槲皮素的含量更能體現(xiàn)苦蕎茶質(zhì)量[12]。同時(shí),苦蕎茶主要被用來沖泡并飲用茶湯,進(jìn)一步研究苦蕎茶經(jīng)熱水沖泡后,其蘆丁、槲皮素的溶出率能更加直觀反映出消費(fèi)者通過飲用苦蕎茶所攝入蘆丁、槲皮素的量[10]。

本文按照四川省地方標(biāo)準(zhǔn)《涼山苦蕎茶》將市售14款苦蕎茶分為:全麥(胚)苦蕎茶和造粒成型苦蕎茶兩類[13]。全麥(胚)苦蕎茶是以苦蕎麥為原料,經(jīng)蒸煮、干燥、碾成米粒狀,再烘焙、包裝而成的苦蕎茶;造粒成型苦蕎茶以苦蕎麥、苦蕎植株全株或不同部分為基本原料,輔以天然食用配料,經(jīng)篩選、研磨、混合、定型、烘焙、包裝而成的苦蕎茶[13]。采用HPLC法測(cè)定上述14款苦蕎茶中蘆丁、槲皮素含量[14],并對(duì)兩類苦蕎茶及其沖泡液中蘆丁、槲皮素的含量進(jìn)行研究,以期為消費(fèi)者選購苦蕎茶提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆丁 批號(hào)100080-201409,純度91.9%,中國(guó)食品藥品檢定研究院;槲皮素 批號(hào)100081-201610,純度99.1%,中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇 色譜純,OCEANPAK;純水 娃哈哈純凈水;其余試劑均為分析純;苦蕎茶樣品 均購于網(wǎng)絡(luò)旗艦店,見表1。

表1 苦蕎茶樣品Table 1 Tartary buckwheat tea sample

UltiMate 3000高效液相色譜儀 賽默飛世爾科技;CP124C電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;EX125ZH電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司;KQ5200E型超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司;Phenomenex C18色譜柱(250 mm×4.60 mm,5 μm) 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 蘆丁、槲皮素含量的測(cè)定

1.2.1 溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備:取蘆丁對(duì)照品、槲皮素對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇分別制成每1 mL含蘆丁0.1 mg、槲皮素0.02 mg的混合溶液。

供試品溶液的制備:苦蕎茶,粉碎(過50目篩)取約1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加熱回流2次,每次精密加入70%甲醇50 mL,回流30 min,搖勻,濾過,合并濾液,置100 mL量瓶中,加70%甲醇至刻度,搖勻,即得。

1.2.2 色譜條件 Phenomenex C18色譜柱(250 mm×4.60 mm,5 μm);以甲醇為流動(dòng)相A,以0.1%冰醋酸溶液為流動(dòng)相B,按表2中的條件進(jìn)行梯度洗脫;流速為1.0 mL·min-1;柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為257 nm?；旌蠈?duì)照品溶液、供試品溶液、甲醇溶液各取10 μL注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖。

表2 梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions

1.3 方法學(xué)考察

1.3.1 線性關(guān)系 精密稱取蘆丁、槲皮素對(duì)照品適量,加甲醇溶解,逐級(jí)稀釋,使其質(zhì)量濃度蘆丁(以蘆丁質(zhì)量濃度計(jì))分別為0.00362、0.00906、0.01812、0.03625、0.18122、0.45307、0.90613 mg·mL-1,槲皮素(以槲皮素濃度計(jì))分別為0.01439、0.02878、0.05756、0.28779、0.71947 mg·mL-1。分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀,按1.2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。

1.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取樣品S11,按1.2.1項(xiàng)制備供試品溶液并精密吸取10 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積,計(jì)算RSD值。

1.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 1.3.2項(xiàng)所制備供試品溶液在0、2、4、6、8、10、12 h分別進(jìn)樣10 μL,測(cè)定峰面積,計(jì)算RSD值。

1.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取樣品S11,按1.2.1項(xiàng)制備供試品溶液5份,分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀,測(cè)定峰面積,并計(jì)算樣品中蘆丁、槲皮素含量的RSD。

表3 蘆丁加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Test result of the rate of rutin recovery

1.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 稱取已知含量的樣品S11粉末9份,每份0.25 g,分別精密加入對(duì)照品溶液(蘆丁質(zhì)量濃度為1.15 mg·mL-1,槲皮素質(zhì)量濃度為0.36 mg·mL-1)各1 mL,2 mL,3 mL,每個(gè)梯度平行3份,定容到25 mL,按供試品溶液的制備方法制備得供試品溶液。按1.2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,計(jì)算回收率。

1.4 蘆丁、槲皮素含量測(cè)定

1.4.1 不同苦蕎茶中蘆丁、槲皮素含量測(cè)定 將市售14款苦蕎茶按1.2.1中方法制備供試品溶液,按1.2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

1.4.2 不同苦蕎茶沖泡液中蘆丁、槲皮素含量測(cè)定 將市售14款苦蕎茶分別準(zhǔn)確稱取2 g,置于燒杯中,向杯中注入100 mL沸水,沖泡5 min,過濾,連續(xù)沖泡6次,收集茶湯,合并后計(jì)量茶湯體積,作為待測(cè)樣品,測(cè)定其蘆丁、槲皮素含量。根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算苦蕎茶沖泡后蘆丁(槲皮素)溶出率及總?cè)艹雎?。?jì)算公式為:

蘆丁(槲皮素)溶出率(%)=沖泡液中蘆丁(槲皮素)含量/苦蕎茶中蘆丁(槲皮素)含量×100

總?cè)艹雎?%)=(沖泡液中蘆丁含量+沖泡液中槲皮素含量)/(苦蕎茶中蘆丁含量+苦蕎茶中槲皮素含量)×100

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)平行3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS Statistics 22進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和圖形繪制,色譜圖的疊加和處理,采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2.0版)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁、槲皮素含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.1.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按1.2.2色譜條件,取對(duì)照品溶液、供試品溶液和溶劑分別進(jìn)樣記錄色譜圖,見圖1。由圖1可知,蘆丁和槲皮素與雜質(zhì)峰達(dá)到了較好的基線分離,溶劑對(duì)其含量測(cè)定無影響。供試品溶液中蘆丁、槲皮素保留時(shí)間分別為6.273、8.820 min,理論塔板數(shù)分別為13584、16637,分離度大于10。

圖1 對(duì)照品溶液(A)、樣品溶液(B)及溶劑(C)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference solution(A),sample solution(B)and solvent(C)注:1:蘆丁,2:槲皮素。

2.1.2 線性關(guān)系 以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得蘆丁線性線回歸方程:Y=332.91X+0.45(X濃度、Y峰面積,r=0.9996),在0.00362～0.90613 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系;槲皮素線性線回歸方程:y=626.25x+0.51,(x濃度、y峰面積,r=0.9998),在0.01439～0.71947 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 連續(xù)進(jìn)樣6次,蘆丁峰面積RSD為0.12%,槲皮素峰面積RSD為0.13%,表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 在0、2、4、6、8、10、12 h分別進(jìn)樣10 μL,蘆丁峰面積的RSD為0.69%,槲皮素峰面積的RSD為1.10%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 槲皮素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Test results of the rate of quercetin recovery

2.1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密吸取5份供試品溶液10 μL,進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,蘆丁的質(zhì)量濃度為9.17 mg·g-1,RSD為1.71%;槲皮素的質(zhì)量濃度為3.17 mg·g-1,RSD為2.13%。表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 9份供試品按1.2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,計(jì)算回收率,見表3、表4,蘆丁、槲皮素的回收率分別為101.99%、98.37%,RSD分別為1.71%、2.03%。表明建立的方法準(zhǔn)確度良好。

表5 不同苦蕎茶樣品中蘆丁和槲皮素含量測(cè)定Table 5 Content of rutin and quercetin in different tartary buckwheat tea

2.2 不同苦蕎茶中蘆丁、槲皮素含量測(cè)定

市售14款苦蕎茶中蘆丁、槲皮素含量測(cè)定結(jié)果如表5所示。造粒成型苦蕎茶中槲皮素含量較高;而全麥(胚)苦蕎茶中蘆丁含量較高。造粒成型苦蕎茶中蘆丁含量較全麥(胚)苦蕎茶低,樣品S4、S6中蘆丁含量不足1.0 mg·g-1,而槲皮素含量和蘆丁、槲皮素總量除樣品S6外均高于全麥(胚)苦蕎茶。全麥(胚)苦蕎茶樣品S8、S12～S14中,槲皮素含量不足0.5 mg·g-1。

Germ、孫曉靜等[15-16]研究發(fā)現(xiàn),苦蕎中槲皮素常以苷(即蘆丁)的形式存在,造粒成型苦蕎茶在制粒的過程中加入水,使蘆丁在酶的作用下發(fā)生水解生成槲皮素。因此,造粒成型苦蕎茶中槲皮素含量較高,而蘆丁含量較少。全麥(胚)苦蕎茶通過蒸煮工序使酶迅速失活,蘆丁水解成槲皮素的量較少,槲皮素含量也較少[17-18]。邵美紅等[19-21]研究表明,苦蕎葉、花中的總黃酮含量較高,而根、莖、麩皮、種子中的含量較低。造粒成型苦蕎茶在制作中,加入了黃酮含量較高的葉、花,故造粒成型苦蕎茶產(chǎn)品中的蘆丁和槲皮素總量較高。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。

2.3 不同苦蕎茶沖泡液中蘆丁、槲皮素含量測(cè)定

不同苦蕎茶沖泡液中蘆丁、槲皮素含量測(cè)定結(jié)果如表6所示,并結(jié)合表5中對(duì)應(yīng)苦蕎茶中蘆丁、槲皮素含量計(jì)算其溶出率。蘆丁溶出率可高達(dá)102.38%,槲皮素溶出率最高僅27.43%。造粒成型苦蕎茶S4沖泡液中未檢出蘆丁,全麥(胚)苦蕎茶S8、S13、S14中槲皮素含量較低,其沖泡液中未檢出槲皮素。造粒成型苦蕎茶沖泡液中以槲皮素為主,而全麥(胚)苦蕎茶沖泡液中以蘆丁為主,除S10、S11外,槲皮素含量均不足0.1 mg·g-1。沖泡液中蘆丁、槲皮素總量和總?cè)艹雎食齋11外,全麥(胚)苦蕎茶>造粒成型苦蕎茶。

表6 不同苦蕎茶沖泡液中蘆丁和槲皮素含量測(cè)定Table 6 Content of rutin and quercetin in brewing solution of different tartary buckwheat tea

由表7結(jié)果可知,造粒成型苦蕎茶中蘆丁、槲皮素總量17.34 mg·g-1,且槲皮素占比達(dá)89.10%,其沖泡液中蘆丁、槲皮素溶出量分別為0.46、2.83 mg·g-1,總?cè)艹雎?9.41%。全麥(胚)苦蕎茶中蘆丁、槲皮素總量11.96 mg·g-1,蘆丁占91.39%,其沖泡液中蘆丁、槲皮素溶出量分別為7.85、0.09 mg·g-1,總?cè)艹雎?7.86%?？嗍w茶中蘆丁、槲皮素總量:造粒成型苦蕎茶>全麥(胚)苦蕎茶,且差異顯著(P<0.05);苦蕎茶沖泡液中蘆丁、槲皮素總量及總?cè)艹雎?造粒成型苦蕎茶<全麥(胚)苦蕎茶,且差異極顯著(P<0.01)。

表7 造粒成型苦蕎茶和全麥(胚)苦蕎茶蘆丁、槲皮素含量及溶出率比較Table 7 Comparison of rutin and quercetin contents and dissolution ratein granulated tartary buckwheat tea and whole wheat(embryo)tartary buckwheat tea

不同類型苦蕎茶沖泡液中,蘆丁、槲皮素的溶出率呈現(xiàn)不同的規(guī)律。造粒成型苦蕎茶經(jīng)擠壓成型,顆粒較緊實(shí),成分較難溶出,且其含量較高的槲皮素水溶性較差(小于0.1 g/100 mL)[22],故總?cè)艹雎瘦^低。而全麥(胚)苦蕎茶在加工中會(huì)進(jìn)行膨化處理,籽粒較疏松,且其含量較高的蘆丁水溶性優(yōu)于槲皮素[23-24],故總?cè)艹雎瘦^高,結(jié)合表6可知,部分產(chǎn)品經(jīng)多次沖泡后,其蘆丁能夠完全溶出。

2.4 不同苦蕎茶及其沖泡液中蘆丁、槲皮素含量的聚類分析

聚類分析是將樣品按照品質(zhì)特性相似程度逐漸聚合在一起,最終按照類別的綜合性質(zhì)多個(gè)品種聚合,從而完成聚類分析的過程[25-26]。本文以不同苦蕎茶蘆丁、槲皮素含量及其沖泡液中蘆丁、槲皮素溶出率為指標(biāo),采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法,結(jié)合平方Euclidean 距離,對(duì)14款苦蕎茶進(jìn)行聚類分析結(jié)果見圖2。

圖2 苦蕎茶樣品聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram of cluster analysis oftartary buckwheat tea samples

由圖2可知,14款苦蕎茶可分成2類,第一類包括樣品S1～S6,為造粒成型苦蕎茶,該類樣品特征為苦蕎茶中蘆丁、槲皮素之和較高(平均含量17.34 mg·g-1),其中槲皮素占89.10%;沖泡液中蘆丁、槲皮素之和(平均含量3.28 mg·g-1)較低,總?cè)艹雎瘦^低(平均溶出率19.41%)。第二類包括樣品S7～S14,為全麥(胚)苦蕎茶,該類樣品特征為苦蕎茶中蘆丁、槲皮素之和較低(平均含量11.96 mg·g-1),其中蘆丁占91.39%;沖泡液中蘆丁、槲皮素之和(平均含量7.94 mg·g-1)較高,總?cè)艹雎瘦^高(平均溶出率67.86%)。聚類結(jié)果將不同苦蕎茶按照其蘆丁、槲皮素含量和沖泡液中蘆丁、槲皮素溶出率的差異性區(qū)分開,反映了造粒成型苦蕎茶和全麥(胚)苦蕎茶之間的差異性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定苦蕎茶及其沖泡液中蘆丁和槲皮素的含量,該方法簡(jiǎn)便快捷,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。通過對(duì)不同苦蕎茶及其沖泡液中蘆丁、槲皮素含量的比較得出:造粒成型苦蕎茶中蘆丁、槲皮素總量顯著高于全麥(胚)苦蕎茶(P<0.05);但由于造粒成型苦蕎茶中蘆丁、槲皮素較難溶出,其沖泡液中蘆丁、槲皮素總量極顯著低于全麥(胚)苦蕎茶(P<0.01)。消費(fèi)者在選擇苦蕎茶產(chǎn)品時(shí),如僅飲用其沖泡液(即茶湯),選全麥(胚)苦蕎茶能夠獲取更多的蘆丁、槲皮素;如在飲用茶湯的同時(shí)將茶渣一起食用,選造粒成型苦蕎茶能夠獲取更多的蘆丁、槲皮素。