(福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院,福建福州 350007)

粗毛纖孔菌(Inonotushispidus)屬于銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)纖孔菌屬(Inonotus),又名粗毛黃褐孔,是一種珍惜的藥用真菌[1]。該菌以寄生為主,主要分布于新疆、寧夏、內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林等北溫帶地區(qū)[2-3]。該菌在民間作為“桑黃”采集入藥,常用于糖尿病、痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎等疾病[2]。經(jīng)國內(nèi)專家學(xué)者對該菌進(jìn)行考證,發(fā)現(xiàn)該菌即為古代中藥“桑黃”[4-5]。此外,大量研究表明該菌具有多種生物活性,如抗病毒[6]、抗氧化[7-9]、抗腫瘤[10-13]、降血脂[14]、活血化瘀[15-16]、保肝[17]及提高免疫力[18]等作用。目前對該菌的研究主要集中在鑒定[9,19]、菌種篩選[20]、栽培[21-22]以及多糖[7]、酚類化合物[9]、三萜[14]等生物活性代謝物及小分子化合物[11]的提取及研究方面。

已有研究表明,食藥用菌如平菇、雙孢菇、雨傘菇、草菇、榆黃菇、牛肝菌、靈芝等具有轉(zhuǎn)化無機(jī)硒并積累有機(jī)硒元素的有效機(jī)制[39-44]。理論上野生食藥用菌中硒含量應(yīng)具較高水平,但實際上大多數(shù)野生食藥用物種都處于硒缺乏狀態(tài),每克子實體干重含硒濃度小于1 μg[45]。研究表明,食藥用菌積累微量營養(yǎng)素的能力受土壤基質(zhì)、真菌種類和元素類型的影響[46],且生長基質(zhì)中硒的濃度也會阻礙食藥用菌菌絲的生長和子實體的形成[47-48]。因此,了解食藥用菌對無機(jī)硒的耐受度及合理的富硒培養(yǎng)基成分是生產(chǎn)富硒功能性食藥用菌的前提條件?，F(xiàn)如今,關(guān)于粗毛纖孔菌對無機(jī)硒的耐受度及富硒培養(yǎng)基成分還鮮有報道。本研究通過響應(yīng)面法對富硒粗毛纖孔菌菌絲生長培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化,旨在減少無機(jī)硒對粗毛纖孔菌的抑制作用,最大程度保證該菌菌絲能夠在富硒的同時,正常甚至更好地生長,提高富硒菌絲的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗毛纖孔菌(Inonotushispidus) 福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心提供;亞硒酸鈉 西亞試劑公司;葡萄糖 西隴科學(xué)股份有限公司;硫酸鎂 阿拉丁工業(yè)有限公司;磷酸二氫鉀 西隴科學(xué)股份有限公司;VB1山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;濃硝酸 南京化學(xué)試劑股份有限公司;母種培養(yǎng)基 為改良PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g/L、葡萄糖30 g/L、硫酸鎂0.75 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、維生素B1(VB1)1 mg/L、瓊脂15 g/L。

LDZX-50FBS高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-2A超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;HPX-9272MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司;X-seriesⅡ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 Thermo股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 母種活化及接種 取粗毛纖孔菌斜面母種約0.25 cm2接種于改良PDA平板中,倒置于恒溫培養(yǎng)箱30 ℃暗光培養(yǎng)。待菌絲生長覆蓋至平板2/3左右,于菌落邊緣取直徑為0.6 cm活化菌塊作為后續(xù)實驗?zāi)阜N。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 硒濃度對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 以改良PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),向其中添加1 mg/mL亞硒酸鈉溶液,通過梯度稀釋法配制硒濃度分別為2.33、4.66、9.31、18.63、37.25、74.5、149、298和596 mg/L的供試培養(yǎng)基,以無硒添加的改良PDA培養(yǎng)基為對照(CK)。將供試培養(yǎng)基注入滅菌(121 ℃、20 min)后的培養(yǎng)皿,每皿約25 mL,冷卻凝固后接入直徑為0.6 cm的活化菌塊,每個濃度5個重復(fù)。30 ℃暗光倒置培養(yǎng)8 d后,觀察粗毛纖孔菌菌絲生長情況,使用游標(biāo)卡尺利用十字交叉法精確測量菌落生長直徑,記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2.2 常規(guī)培養(yǎng)料對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 以改良PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別配制麩皮、玉米粉、大米、豆粉培養(yǎng)基,用以篩選粗毛纖孔菌菌絲最適生長培養(yǎng)料。其中:

麩皮培養(yǎng)基:麩皮50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,pH自然。

玉米粉培養(yǎng)基:玉米粉50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,pH自然。

大米培養(yǎng)基:大米50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,pH自然。

豆粉培養(yǎng)基:豆粉50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,pH自然。

每種培養(yǎng)基5個重復(fù),30 ℃暗光倒置培養(yǎng)8 d后觀察粗毛纖孔菌菌絲生長情況,測量并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2.3 補(bǔ)充碳源對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 以改良PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),將培養(yǎng)基中的葡萄糖(30 g/L)調(diào)整為等量蔗糖、乳糖、果糖或海藻糖,每種培養(yǎng)基5個重復(fù),30 ℃暗光倒置培養(yǎng)8 d后觀察粗毛纖孔菌菌絲生長情況,測量并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2.4 培養(yǎng)基pH對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 多數(shù)食藥用菌適宜在微酸和中性pH條件下生長,因此,以改良PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),將培養(yǎng)基pH分別調(diào)整為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,每種培養(yǎng)基5個重復(fù),30 ℃暗光倒置培養(yǎng)8 d后觀察粗毛纖孔菌菌絲生長情況,測量并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 Box-Behnken design優(yōu)化粗毛纖孔菌菌絲 富硒培養(yǎng)基配方為考察培養(yǎng)基各成分與外源硒對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響及其之間的交互效應(yīng),以單因素實驗結(jié)果為依據(jù),以粗毛纖孔菌菌絲生長速度為指標(biāo)(Y),在最適pH條件下,采用Box-Behnken模型設(shè)計三因素、三水平組合實驗(表1),對結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到最優(yōu)響應(yīng)Y值,從而得到最佳富硒粗毛纖孔菌菌絲培養(yǎng)基配方。

表1 BBD實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of BBD experiment

1.2.4 菌絲生長情況檢測 菌絲生長情況通過菌絲平均生長速度進(jìn)行評估,利用十字交叉法對培養(yǎng)后平板內(nèi)粗毛纖孔菌菌絲進(jìn)行測量,測量所得菌絲生長直徑除以培養(yǎng)時間即為菌絲生長速度,其中菌絲生長直徑為測量獲得總直徑減去初始直徑。最大耐受濃度(MTC)指不引起受試對象出現(xiàn)死亡的最高計量,即當(dāng)實驗濃度處于最大耐受濃度時,菌絲體有生長;而實驗濃度高于MTC時,則生長被完全抑制。

1.2.5 富硒粗毛纖孔菌菌絲硒含量的測定 參考食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 5009.268-2016)[49],采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS),精確稱取富硒粗毛纖孔菌菌絲干試樣0.5 g于聚四氟乙烯消解內(nèi)罐,加5 mL硝酸浸泡過夜。封好消解罐放入恒溫干燥箱,160 ℃保持6 h,自然冷卻至室溫后打開加熱趕酸至近干,將消化液吸入25 mL容量瓶中,用少量1%硝酸溶液洗滌內(nèi)罐和內(nèi)蓋3次,合并洗液,用1%硝酸定容,混勻備用。將試樣溶液與空白溶液分別注入電感耦合等離子體質(zhì)譜儀中,測定硒元素含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用DPS 7.05軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機(jī)單因素方差分析,采用Tukey多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗。利用Design-Expert 8. 06軟件對響應(yīng)面實驗進(jìn)行設(shè)計、分析并繪制響應(yīng)曲面。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 硒濃度對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 由圖1可知,粗毛纖孔菌菌絲的生長情況受外源硒影響較大。當(dāng)培養(yǎng)基中所添加硒濃度≤18.63 mg/L時,粗毛纖孔菌菌絲的生長速度與對照組無顯著性差異(P>0.05)。隨處理濃度的升高,當(dāng)硒濃度≥37.25 mg/L時,粗毛纖孔菌菌絲生長開始受到明顯的抑制,其生長速度顯著性降低(P<0.05)。當(dāng)硒濃度達(dá)到298 mg/L時,粗毛纖孔菌菌絲略有生長,其生長速度與零生長組(即完全抑制組,硒濃度為596 mg/L)無顯著性差異(P>0.05)。因此,粗毛纖孔菌菌絲對硒的最大耐受濃度為298～596 mg/L,而后續(xù)實驗中硒的濃度以18.63 mg/L為宜。

圖1 硒濃度對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的影響Fig.1 Effect of Se concentration on themycelia growth rate of I.hispidus注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖2～圖4同。

2.1.2 常規(guī)培養(yǎng)料對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 由圖2可知,粗毛纖孔菌菌絲在常規(guī)培養(yǎng)料配制的培養(yǎng)基上均能生長,但其菌絲生長速度存在顯著性差異(P<0.05),且菌絲稠密度相差較大。粗毛纖孔菌在麩皮培養(yǎng)基上生長效果最好,其菌絲的生長速度可達(dá)到6.6 mm/d,且菌絲稠密度最高;其次為改良PDA培養(yǎng)基;以玉米粉、大米、豆粉為培養(yǎng)料時,其菌絲生長速度顯著降低(P<0.05),且菌絲稠密度明顯弱于改良PDA培養(yǎng)基。此外,粗毛纖孔菌菌絲對玉米粉的可利用度最低。因此,后續(xù)實驗選取麩皮為培養(yǎng)基。

圖2 常規(guī)培養(yǎng)料對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的影響Fig.2 Effect of the principal components of culture mediumon the mycelia growth rate of I.hispidus注:菌絲的稠密度:+++:CK程度,++++:高于CK程度,++:低于CK程度,+:低于++程度;圖3、圖6同。

2.1.3 補(bǔ)充碳源對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 如圖3所示,粗毛纖孔菌對不同補(bǔ)充碳源的可利用度不同,以不同類型的補(bǔ)充碳源作為培養(yǎng)基成分,其菌絲生長速度存在顯著性差異(P<0.05),且菌絲稠密度相差較大。當(dāng)以葡萄糖作為補(bǔ)充碳源時,粗毛纖孔菌菌絲生長速度最高,菌絲稠密度最佳;以蔗糖、果糖、海藻糖作為補(bǔ)充碳源時,其菌絲生長速度稍低,菌絲稠密度則明顯弱于葡萄糖的效果。粗毛纖孔菌菌絲對乳糖的可利用度最低。因此,后續(xù)實驗選取葡萄糖作為補(bǔ)充碳源。

圖3 補(bǔ)充碳源對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的影響Fig.3 Effect of supplementary carbon sourceon the mycelia growth rate of I. hispidus

2.1.4 pH對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 由圖4可知,當(dāng)pH條件偏酸時,該粗毛纖孔菌菌絲生長速度偏低;當(dāng)pH處于6.5～7.5時,該粗毛纖孔菌菌絲生長速度先隨pH的增大而增加,再隨pH的增大而降低,于pH7.0時達(dá)到最佳,表明該粗毛纖孔菌菌株在中性pH條件下長勢最好。因此,后續(xù)實驗中pH條件以7.0為宜。

圖4 pH對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的影響Fig.4 Effect of pH on the mycelia growth rate of I.hispidus

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化粗毛纖孔菌菌絲富硒培養(yǎng)基配方

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析 通過Design-Expert 8.06軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗,基于單因素結(jié)果,以麩皮(X1)、葡萄糖(X2)及硒(X3)為自變量,以粗毛纖孔菌菌絲生長速率平均值為響應(yīng)值(Y),進(jìn)行響應(yīng)面試驗,試驗方案與結(jié)果見表2。通過Design-Expert 8.06對表2結(jié)果進(jìn)行分析,得到的3因素與菌絲生長速度(Y)之間的回歸模型可以表述為:

表2 BBD實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design matrix and the results of Box-Behnken

2.2.2 各因素交互作用對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的響應(yīng)面分析 為考慮交互作用對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的影響,在另一因素條件固定不變(編碼水平為零)的情況下,分析兩兩因素交互作用對其菌絲生長速度的影響。通過Design-Expert 8.06軟件處理上述實驗設(shè)計得到3D響應(yīng)曲面圖和等高線分析圖(圖5),可以直觀地看出各個因子之間的交互作用對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的影響。響應(yīng)面分析中,等高線的形狀可以反映兩因素間交互作應(yīng)對響應(yīng)值影響的強(qiáng)弱大小,圓形表示不顯著,橢圓形則與之相反;等高線的稀疏情況反映響應(yīng)面圖像的平陡情況。從圖5可以看出,兩兩因素之間的等高線形狀均為橢圓形,表明其交互作用顯著。由圖5A可知,粗毛纖孔菌菌絲生長速度(Y)隨麩皮添加量(X1)和葡萄糖添加量(X2)的增加而增加;由圖5B可見,粗毛纖孔菌菌絲生長速度(Y)隨麩皮添加量(X1)的增加和硒添加量(X3)的減小而增加;在較小硒添加(X3)情況下,麩皮添加量(X1)

表3 菌絲生長速度響應(yīng)模型的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model of mycelia growth rate

圖5 兩兩因素交互作用對粗毛纖孔菌菌絲生長速度影響的響應(yīng)曲面圖和等高線分析圖Fig.5 The interactive effects between(A)bran and glucose,(B)bran and Se,(C)glucose and Seon I. hispidus mycelia growth rate showed by 3-D response surface and 2-D contour plots

在很大的范圍內(nèi)均可取到較大的Y值;圖5C也表現(xiàn)出與圖5B相同的趨勢,表明硒添加對粗毛纖孔菌菌絲生長不利,但可以通過其他因素與其交互作用減少其對粗毛纖孔菌菌絲生長抑制作用的影響。綜合各圖,各因素之間的交互作用與回歸模型的方差分析結(jié)果相吻合。由Design-Expert 8.06軟件分析得到最大響應(yīng)值(Y)時最優(yōu)培養(yǎng)基配方為:麩皮56.8 g/L、葡萄糖49 g/L、Se 22.4 mg/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,此時富硒粗毛纖孔菌菌絲生長速度預(yù)測值為8.19 mm/d。

2.3 驗證實驗

為了檢測響應(yīng)面結(jié)果的準(zhǔn)確性,以改良PDA培養(yǎng)基為陰性對照,以等量硒添加改良PDA培養(yǎng)基為陽性對照,配制上述最優(yōu)培養(yǎng)基配方進(jìn)行富硒粗毛纖孔菌菌絲培養(yǎng)實驗,每組八個重復(fù),測得粗毛纖孔菌及富硒粗毛纖孔菌菌絲生長速度見圖6。響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基實測值8.41 mm/d>預(yù)測值8.19 mm/d>改良PDA實測值6.79 mm/d>等量硒添加改良PDA實測值 4.28 mm/d,且優(yōu)化后的富硒培養(yǎng)基培養(yǎng)的粗毛纖孔菌菌絲的稠密度更高(圖6)。與等量硒添加改良PDA相比,以響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),粗毛纖孔菌菌絲生長速度提高了0.965倍。此外,通過電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)對最優(yōu)培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲的硒富集量進(jìn)行檢測,測得富硒粗毛纖孔菌菌絲硒富集量為31.584 μg/g。說明采用響應(yīng)面法獲得的模型能較好地預(yù)測富硒粗毛纖孔菌菌絲的生長情況,該富硒培養(yǎng)基配方可以減少外源硒對粗毛纖孔菌菌絲抑制作用的影響,使其能夠在富硒的同時正常甚至更好地生長,提高富硒菌絲的產(chǎn)量,具有一定的實用價值。

圖6 驗證實驗結(jié)果Fig.6 The results of verification test

3 結(jié)論

首次針對粗毛纖孔菌對無機(jī)硒的耐受度進(jìn)行探索,發(fā)現(xiàn)該菌菌絲的生長情況受外源硒影響較大,當(dāng)硒濃度達(dá)到或大于37.25 mg/L時,該菌菌絲生長受到顯著的抑制作用(P<0.05)。因此,本研究通過響應(yīng)面法對該菌富硒培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化,旨在保證該菌菌絲在正常生長情況下合理富集、積累并轉(zhuǎn)化無機(jī)硒為有機(jī)硒,提高富硒粗毛纖孔菌菌絲的產(chǎn)量。

經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化得到富硒粗毛纖孔菌菌絲生長最優(yōu)培養(yǎng)基配方為:麩皮56.8 g/L、葡萄糖49 g/L、Se 22.4 mg/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L。其中葡萄糖添加量、麩皮添加量和硒添加量對富硒粗毛纖孔菌菌絲生長均具有極顯著作用;且麩皮與葡萄糖、麩皮與硒添加、葡萄糖與硒添加之間的兩兩交互作用對富硒粗毛纖孔菌菌絲生長均具有顯著作用(P<0.01)。在此條件下,富硒粗毛纖孔菌實際菌絲生長速度達(dá)到8.41 mm/d,與預(yù)測值相符,且硒富集量達(dá)到31.584 μg/g。說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化獲得的富硒粗毛纖孔菌菌絲生長培養(yǎng)基配方具有一定的實用價值。

該配方通過培養(yǎng)基內(nèi)因素間的交互作用減少了外源硒對粗毛纖孔菌菌絲生長抑制作用的影響,確定了合理的硒添加比例,與等量硒添加改良PDA相比,優(yōu)化后粗毛纖孔菌菌絲生長速度提高了約1倍(0.965倍);與同配方無硒添加培養(yǎng)基相比,菌絲硒含量增加為31.584 μg/g。國際營養(yǎng)聯(lián)合會規(guī)定缺硒人群每人每天食用硒量不少于50 μg,每人每天食用本研究富硒粗毛纖孔菌制品1.58 g即可完全滿足此要求。本研究在硒抑制與菌絲生長之間找到平衡點(diǎn),獲得了最優(yōu)配方,為富硒粗毛纖孔菌菌絲體的大量制備、富硒粗毛纖孔菌子實體的栽培及其它后續(xù)研究提供了理論依據(jù)。